虎杖根茎超临界CO2萃取物GC/MS分析及抗细胞迁移活性评价

李武国，刘嘉炜，李庆国，叶玉珊，司马贞华

(1. 广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，岭南中药资源教育部重点实验室，广东 广州 510006；2. 广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)

虎杖为蓼科植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc.)的干燥根茎，具有散瘀定痛、祛风利湿、止咳化痰之功效。在传统医学中，主要用于咳嗽痰多、关节痹痛、湿热黄疸、痈肿疮毒和癓瘕等病症[1]；现代药理研究表明，虎杖具有抗流感病毒、抗艾滋病毒、抗菌、抗肿瘤和抗炎症等药理作用[2]。利用传统植物化学手段对虎杖化学成分进行研究表明，其根茎部位主要含有联苯乙烯类、醌类和黄酮类等化学成分[3-4]，其中，对联苯乙烯类白藜芦醇衍生物和蒽醌类衍生物的提取分离研究较为深入，其萃取方法有溶剂萃取、超声波辅助萃取和微波辅助萃取等[5-6]；利用水蒸气蒸馏法提取虎杖挥发油的GC/MS分析结果表明，其根茎部位还含有噻吩类、菲类、萘类和联苯类等挥发性化学成分[7]；但利用超临界CO2萃取虎杖根茎挥发性化学成分，并采用GC/MS法对其进行分析还未见报道。与传统的萃取方法(如水蒸气蒸馏、有机溶剂萃取等)相比，超临界CO2萃取是一种新型的现代“绿色分离”技术，具有无溶剂残留、无热分解破坏、对挥发性小分子化合物的提取效率高等优点[8]。

近年来，本课题组利用植物化学研究方法对虎杖根茎活性化学成分进行了深入研究，基于药理活性导向法从虎杖提取物中分离鉴定出一组H1N1流感病毒神经氨酸酶抑制剂[3]和新型IL-6/STAT3信号通路抑制剂[9]。这为植物来源靶向抗流感病毒和抗肿瘤药物的研发提供了结构信息和参考，同时还发现该药材乙酸乙酯提取物含有一些低极性化合物，其成分复杂、结构相似，利用传统植物化学方法难以纯化分离获得单体化合物来进行结构鉴定。为了从不同角度探讨虎杖根茎部位的药效物质基础，本研究采用超临界CO2萃取技术对其根茎粉末进行萃取，对萃取物进行GC/MS分离分析，并利用体外伤口愈合模型评价其抗细胞迁移活性。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

HA121-50-05型超临界流体萃取仪：江苏华安科研仪器有限公司产品；R-1001N型旋转蒸发仪：郑州长城科工贸有限公司产品；Voyager型气相色谱-质谱联用仪：美国Finnigan公司产品，配有NIST05质谱检索库；3111型CO2细胞培养箱：美国Thermo Scientific公司产品；CKX41型相差倒置显微镜：日本Olympus公司产品；TC10型细胞计数仪：美国Bio-Rad公司产品；TGL-16G型高速台式离心机：上海安亭科学仪器公司产品。

1.2 主要材料与试剂

虎杖药材(批号：091101)：购自广州致信药业有限公司，由广州中医药大学中药学院中药鉴定教研室彭光天博士鉴定；人肝癌细胞株Huh-7：由郑州大学医药科学研究院提供；二氧化碳(纯度99.9%)、氦气(纯度99.99%)、95%乙醇、无水硫酸钠、DMSO、乙醚及其他试剂均为分析纯；DMEM培养液(C11995)、PBS缓冲液(C10010)、胎牛血清(10099)、0.25% Trypsin-EDTA(25200)、Pen Strep(15140)：均为美国Gibco公司产品。

1.3 实验条件

1.3.1虎杖根茎超临界CO2萃取物的萃取

取2 kg粉碎后的虎杖根茎，过50目筛，装入超临界萃取釜中，萃取压力为20 MPa，萃取温度为45 ℃，加入一定量95%乙醇作为夹带剂，萃取时间为2 h。其中，分离釜I的温度为45 ℃，压力为5.4 MPa；分离釜II的温度为50 ℃，压力为5.4 MPa。

1.3.2样品处理 超临界萃取物经旋转蒸发仪回收夹带剂乙醇，取适量浸膏，用乙醚配制成50 g/L溶液，加适量无水Na2SO4，脱水干燥，过0.45 μm微孔滤膜，将滤液进行GC/MS分析。

1.3.3气相色谱条件 TG WAXMS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升温：初始温度50 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；进样口温度220 ℃；载气为高纯氦气，载气流速1 mL/min，恒流模式；分流进样，分流比30∶1，进样量1 μL。

1.3.4质谱条件 离子源温度200 ℃，接口温度230 ℃；电离方式为电子轰击(EI)源，电子轰击能量70 eV；全扫描模式，扫描速度1 975.50 u/s，扫描范围m/z35～600；溶剂延迟时间3 min。

1.3.5相对百分含量的计算 各化学成分通过NIST Search2.0标准质谱图库进行检索匹配，并人工解析质谱，以确证化合物的结构；采用峰面积归一法计算分离鉴定化学成分的相对百分含量。

1.3.6体外细胞迁移测试(伤口愈合模型)[10]

体外培养人来源的肝癌Huh-7细胞株，Huh-7细胞生长至约80%融合时，收集对数生长期的Huh-7细胞，胰酶消化后计数，在6孔板中每孔加入约106个细胞，放入细胞培养箱中培养。细胞接种于6孔板24 h后，吸取各孔中的培养液，用200 μL移液枪头垂直于背后的横线划痕，造成伤口愈合细胞迁移模型，无钙PBS冲洗细胞表面3次以去除细胞残骸和碎片。空白对照组每孔加入2.5 mL 含0.1% DMSO和2% FBS的DMEM培养液，给药组每孔加入2.5 mL 含2% FBS和不同浓度(1、5、10 mg/L)虎杖萃取物的DMEM培养液，每组3个复孔，在37 ℃、5% CO2中培养，0、24、48 h分别在倒置显微镜下拍照，并用image j计算迁移面积。采用SPSS11.0软件对各组细胞迁移数进行统计，并对结果进行单因素方差分析。

1.3.7体外细胞毒性测试[11]体外培养人肝癌Huh-7 细胞株，细胞生长至约80% 融合时，收集对数生长期的Huh-7细胞，消化后计数，在96孔板中每孔加入约104个细胞，放入细胞培养箱中培养。细胞接种于96孔板24 h后，吸取各孔中的培养液，空白对照组每孔加入200 μL含0.4% DMSO和10% FBS的DMEM培养液，给药组每孔加入200 μL含10% FBS和不同浓度(0、1、5、10、20、40、60、80、100 mg/L)虎杖

根茎超临界CO2萃取物的DMEM培养液，每组平行设置3个孔，在37 ℃、5% CO2中培养24 h，每孔加入20 μL 5 g/L MTT，培养4 h，吸取培养基，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min。用酶标仪490 nm测定OD值。

2 结果与讨论

2.1 实验结果

2.1.1超临界CO2萃取及GC/MS分析 在本实验条件下，2 kg虎杖根茎药材粉末经超临界CO2流体萃取，得到4.8 g浸膏，得率为0.24%；对萃取物进行GC/MS分析，得到的总离子流图示于图1。在虎杖根茎超临界CO2萃取物总离子流图中，共分离获得65个化学组分峰，其中鉴定确证33个化合物，占总检测到化学成分相对百分含量的93.6%，详情列于表1。含量较高的化合物是2,3-丁二醇、吉玛烯B、醋酸、丙二醇和莪术烯等，分别占5.9%、6.5%、6.9%、12.2%和41.8%，其中莪术烯含量最高，是虎杖超临界CO2萃取物的主要化学成分之一。

2.1.2体外人肝癌Huh-7 细胞迁移和细胞毒活性测试 虎杖根茎超临界CO2萃取物对体外伤口愈合模型Huh-7细胞迁移测试实验的结果示于图2a和2b。与空白组比较，在浓度为1 mg/L和5 mg/L时，虎杖根茎超临界CO2萃取物对人肝癌细胞Huh-7的细胞迁移活性均没有明显抑制效果，但在浓度为10 mg/L作用24 h时，能较显著地抑制人肝癌细胞Huh-7的细胞迁移活性，抑制率为19.85%(p<0.01)。为了进一步验证虎杖根茎超临界CO2萃取物抑制细胞迁移活性与其细胞毒活性的关系，用不同浓度(0、1、5、10、20、40、60、80、100 mg/L)萃取物分别处理人肝癌Huh-7细胞 24 h。MTT法测试表明，虎杖根茎萃取物在浓度为10 mg/L和20 mg/L时，对人肝癌Huh-7细胞的细胞增殖和细胞存活没有影响；萃取物在浓度为20 mg/L以下时，没有表现出细胞毒性；但在浓度大于 40 mg/L时，对细胞增殖表现出抑制效果，其IC50= 38.6 mg/L，示于图2c。可见，虎杖根茎超临界CO2萃取物在浓度为10 mg/L时，抑制Huh-7细胞迁移的生物机制与其细胞毒活性无直接相关。

图1 虎杖根茎SFE-CO2萃取物的总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of the SFE-CO2 extracts from the rhizomes of Polygonum cuspidatum

峰号保留时间/min化合物名称分子式相对分子质量匹配度/%质量百分数/%18.0 3-甲基-2-丁醇3-Methyl-2-butanol C5H12O8879.10.5 210.0 羟基丁酮Acetoin C4H8O28887.10.6 314.5 醋酸Acetic acid C2H4O26088.76.9 415.3 古巴烯Copaene C15H2420491.30.3 516.0 β-绿叶烯β-Patchoulene C15H2420480.70.1 616.1 α-古芸烯α-Gurjunene C15H2420480.70.2 716.3 δ-新丁香三环烯δ-Neoclovene C15H2420473.30.4 816.4 丙二醇Propylene glycol C3H8O27672.112.2 917.4 异丁子香烯IsocaryophilleneC15H2420482.80.3 1017.6 2,3-丁二醇2,3-Butanediol C4H10O29092.15.9 1117.9 丁子香烯Caryophyllene C15H2420494.00.7 1218.9 甘香烯Elixene C15H2420489.80.3 1319.6 α-石竹烯α-Caryophyllene C15H2420492.40.4 1420.1 β-雪松烯β-Himachalene C15H2420483.30.1 1520.8 β-桉叶烯β-Eudesmene C15H2420492.61.7 1620.8 α-姜烯α-Zingiberene C15H2420484.30.1 1720.9 α-衣兰油烯α-Muurolene C15H2420485.40.1 1821.1 雅榄蓝烯EremophileneC15H2420484.00.2 1921.7 δ-荜澄茄烯δ-Cadinene C15H2420484.70.1 2022.0 β-倍半水芹烯β-Sesquiphellandrene C15H2420489.20.2

续表

峰号保留时间/min化合物名称分子式相对分子质量匹配度/%质量百分数/%2122.1 β-人参烯β-Panasinsene C15H2420488.05.8 2222.6 γ-榄香烯γ-Elemene C15H2420487.60.8 2323.2 吉玛烯B Germacrene B C15H2420486.16.5 2423.9 脱氢香橙烯Dehydro-aromadendrene C15H2220282.40.5 2524.59,10-脱氢异长叶烯9,10-Dehydro-isolongifolene C15H2220286.10.72627.7 反式桂皮醛 (E)-Cinnamaldehyde C9H8O13290.00.1 2729.3 莪术烯Curzerene C15H20O21678.741.8 2832.5 长马鞭草烯酮Longiverbenone C15H22O21882.10.9 2933.7 (-)-斯巴醇 (-)-Spathulenol C15H24O22079.70.1 3035.24,5-脱氢异长叶烯4,5-Dehydro-isolongifolene C15H2220280.82.63137.12-(4a,8-二甲基-2,3,4,4a,5,6-六氢化-奈-2-基)-丙烯-2-乙二胺-1-醇2-(4a,8-Dimethyl-2,3,4,4a,5,6-hexahydro-naphthalen-2-yl)-prop-2-en-1-ol C15H22O21877.90.43242.1 n-棕榈酸n-Hexadecanoic acid C16H32O225680.20.5 3343.38,9-脱氢-9-甲酰基-环异长叶烯8,9-Dehydro-9-formyl-cycloisolongifolene C16H22O23076.61.8

注：a.b.体外伤口愈合模型评价虎杖根茎SFE-CO2萃取物对人肝癌细胞Huh-7的抑制细胞迁移活性(*p<0.05, 与48 h空白比较，**p<0.01, 与24 h空白比较)； c.MTT法评价SFE-CO2萃取物的细胞毒活性图2 虎杖根茎SFE-CO2萃取物对人肝癌Huh-7 细胞迁移和细胞毒活性的作用结果Fig.2 Anti-migration and cytotoxic effects of the supercritical extracts from the rhizomes of Polygonum cuspidatum towards human hepatoma Huh-7 cells

2.2 讨论

本研究采用超临界CO2萃取虎杖根茎的低极性成分，经GC/MS分析，共分离获得65个化学组分峰，并鉴定了其中33种化合物，主要成分为莪术烯、丙二醇、醋酸、吉玛烯B和2,3-丁二醇等化合物。与文献[7]相比，本研究的方法能获得更多的化学成分，而且在主要化学成分的种类上也有很大差异。

体外伤口愈合模型测试表明，虎杖超临界CO2萃取物在浓度为10 mg/L作用24 h和48 h时，均能较显著地抑制人肝癌细胞Huh-7的细胞迁移活性；MTT法测试表明，虎杖超临界CO2萃取物在浓度低于20 mg/L时，对Huh-7细胞的增殖和存活无抑制作用，其体外细胞毒活性IC50为38.6 mg/L。因此，虎杖萃取物抑制细胞迁移的生物活性机制与其细胞毒性无直接相关，其生物活性物质基础可能是萃取物中含量较高的化学成分，如莪术烯等。本实验中，莪术烯是虎杖超临界CO2萃取物相对百分含量较高的成分，占萃取物的 41.8%，因此，莪术烯很可能是虎杖超临界CO2萃取物中抑制人肝癌Huh-7细胞迁移活性的主要成分之一。莪术烯是呋喃二烯结构化合物[12]，该化合物能通过PI3K 信号途径下调细胞内p-Akt, p-Erk 1/2, ICAM-1, p-p85和 p85的蛋白表达水平，从而抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭和血管形成[13]，还能通过MAPK等信号途径诱导肿瘤细胞凋亡和肿瘤侵袭[14-16]。另外，莪术烯也是很多植物挥发油的主要成分之一，如莪术[17]、红果子[18]和Benitez[19]等。现代药理学研究表明，莪术烯对 THP-l 细胞分泌TNFα炎症因子有明显的抑制作用[20]，对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞释放NO表现出显著的抑制活性, IC50为9.4 μmol/L[21]。据此推测，莪术烯可能是虎杖的药效物质基础之一，值得进一步深入研究。

3 结论

利用超临界CO2萃取技术对虎杖根茎粉末进行萃取，并对萃取物进行GC/MS分离分析，得到65个化学组分峰，鉴定了其中的33个化合物，主要成分为莪术烯，进一步测试表明，虎杖根茎超临界CO2萃取物的非细胞毒剂量对人肝癌细胞Huh-7的细胞迁移活性具有抑制效果。

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