肤福牌皮肤消毒护肤喷雾剂的急性、亚急性毒性实验和刺激实验

李健和，江 爱，陈贵秋，胡 焰，王 琼，王 霞，邱细敏

( 1.中南大学湘雅二医院药学部，长沙 410011；2.湖南师范大学医学院，长沙 410012；3.湖南省疾病预防控制中心消毒科，长沙 410005)

肤福牌皮肤消毒护肤喷雾剂是以1%葡萄糖酸氯己定和61%乙醇(w/w)为主药，并辅以护肤保湿成分的溶液型喷雾剂，可杀灭肠道致病菌、化脓性球菌、致病性酵母菌和医院感染常见细菌，同时具有保护及滋润皮肤的作用，用于外科手、注射部位皮肤、一般物体表面等的消毒。现将其研制开发过程中的安全性评价方法与结果报道如下, 以期为安全用药提供依据。

1 药物、仪器和动物

肤福牌皮肤消毒护肤喷雾剂(规格：100 ml/瓶，批号20120919，中南大学湘雅二医院药学部)；注射用环磷酰胺(规格：0.2 g/支，批号20120301，山西泰盛制药有限公司)。AE200电子分析天平(称量范围0～200 g，精度0.1 mg，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)； Sysmex XT-2000i全自动细胞计数仪(日本希森美康株式会社)；Beckman AU680全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司)，Leica DM750M金相显微镜(德国莱卡公司)。

新西兰兔，体重2.1～2.5 kg，饲养在普通环境下，温度 22～25 ℃，湿度52%～56%。 SPF级雌、雄性SD大鼠，体重 140～160 g；SPF级昆明种雌、雄性小鼠，体重18～30 g，饲养在屏蔽环境，温度22～24 ℃，湿度52%～56%。上述实验动物均购自长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2009-0012。

2 方法和结果

依据卫生部2002年版《消毒技术规范》的要求，用肤福牌皮肤消毒护肤喷雾剂进行急性经口毒性实验，多次完整皮肤和一次破损皮肤刺激实验、急性眼刺激实验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验以及亚急性毒性实验。

2.1 急性经口毒性实验 20只SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体重：雌鼠(20.02±1.15) g，雄鼠(20.57±1.02) g。采用一次最大限度实验，剂量为5000 mg/kg。实验时称取样品12.50 g，加蒸馏水定容至50 ml，混匀，按20 ml/kg给小鼠一次性经口灌胃。灌胃前禁食16 h，灌胃后连续观察14 d，记录中毒表现及死亡情况：灌胃后小鼠无明显中毒表现，观察14 d无死亡。实验结束，处死全部小鼠进行大体解剖，肝、肾、脾、胃、肠、心、肺等主要脏器未见肉眼可见的异常改变。在本实验条件下，受试药品对昆明种雌、雄小鼠的急性经口LD50均>5000 mg/kg，属实际无毒级。

2.2 刺激实验

2.2.1 多次完整皮肤刺激实验 取健康白色雌性新西兰兔3只，体重(2.35±0.11) kg。将样品0.5 ml直接涂抹于一侧2.5 cm×2.5 cm大小的去毛皮肤上，另一侧去毛皮肤作为空白对照。涂抹4 h后，用蒸馏水清除残留受试物。每天涂抹1次，连续涂抹14 d。在每次涂抹后24 h观察结果并进行皮肤刺激反应评分和刺激强度评价。结果显示，涂抹受试品侧皮肤和空白对照侧皮肤红斑、水肿的评分均为0分，14 d的总积分均值以及平均每天每只家兔积分均值也均为0分，表明本品对家兔的多次皮肤刺激强度为无刺激性。

2.2.2 一次破损皮肤刺激实验 取健康白色雌性新西兰兔3只，体重(2.32±0.13)kg。将样品0.5 ml直接涂抹于一侧破损皮肤区，然后用一层无刺激油纸覆盖，再用无刺激胶布固定。另一侧去毛破损皮肤用等量灭菌生理盐水作为对照，与前作同样处理。敷用4 h后，用蒸馏水除去残留受试物，分别于去除受试物后1、24、48 h，观察皮肤局部反应并进行刺激反应评分和刺激强度评价。结果显示，除一只兔样品侧1 h水肿的评分为1分外，其余1、24、48 h样品侧与对照侧红斑、水肿的评分均为0分，观察各时间点受试物对家兔的一次破损皮肤刺激反应的最高积分均值为0.33分，表明本品对家兔的一次破损皮肤刺激强度为无刺激性。

2.2.3 急性眼刺激实验 取健康白色雌性新西兰兔3只，体重(2.30±0.15) kg。吸取受试品原液0.1 ml，滴入家兔一侧眼结膜囊内，另一侧眼以灭菌生理盐水作为对照。滴受试物后，将眼被动闭合4 s，30 s后用灭菌生理盐水冲洗。于滴眼后1、24、48、72 h，7、14和21 d肉眼观察家兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤与恢复情况，记录眼刺激反应评分，按眼刺激反应分级标准判定受试物对眼睛的刺激程度。结果显示，滴受试物后1 h，3只家兔用药侧眼结膜血管充血呈鲜红色，2只家兔结膜轻微水肿，1只家兔明显水肿，伴有部分眼睑外翻，角膜、虹膜无损伤。用药后24 h，2只家兔结膜充血评分均为1分，2只家兔结膜水肿评分均为1分，1只家兔结膜水肿评分为2分。用药后48 h，2只家兔结膜水肿评分均为1分。用药后72 h内眼刺激反应完全消失，故观察7 d终止实验。对照侧在上述不同观察时点均未见角膜与虹膜损害、结膜充血和结膜水肿。在本实验条件下，受试物对3只家兔的急性眼刺激实验结果平均评分为：角膜损害=0，虹膜损害=0，结膜充血=0.67，结膜水肿=2，表明本品对家兔急性眼刺激实验的刺激强度为无刺激性。

2.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验 取SPF级昆明种小鼠雌雄各25只，体重：雌鼠(27.38±1.02) g，雄鼠(28.13±1.14) g。按体重随机分为5组，每组10只，雌雄各半，采用经口灌胃30 h染毒法进行动物染毒。以40 mg/kg剂量的环磷酰胺[配制方法：称取注射用环磷酰胺1支(0.2 g)，加蒸馏水定容至100 ml，摇匀]为阳性对照，蒸馏水为阴性对照。受试物3个剂量分别为5000、2000、500 mg/kg。分别称取肤福牌皮肤消毒护肤喷雾剂25.00、10.00、2.50 g加蒸馏水定容至100 ml。给小鼠灌胃2次，每次间隔24 h，灌胃体积为20 ml/kg。末次给样后6 h颈椎脱臼处死小鼠，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光学显微镜下，每只小鼠计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，计算微核率(以千分率计)；计数200个嗜多染红细胞，计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比例(PCE/NCE)。采用SPSS 11.0软件统计分析。结果各剂量受试品组微核率与阴性对照组比较差异无显著性，而环磷酰胺组与阴性对照组比较差异有统计学极显著性意义(P<0.01)。各组PCE/NCE比值均在正常范围内。在本实验室条件下，受试品对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验结果为阴性。

2.4 亚急性毒性实验 取SPF级雌、雄性SD大鼠各20只，体重：雌鼠(149.73±3.82) g，雄鼠(152.88±3.46)g,随机分为4组，即对照组及1000、250、63 mg/kg 3个受试品组，每组10只，雌雄各半。实验时分别称取样品20.00、5.00、1.26 g加蒸馏水定容至200 ml，分别给受试大鼠灌胃，对照组予以等体积的蒸馏水，每天1次，灌胃体积为10 ml/kg，连续28 d。各组大鼠均喂以普通饲料，自由摄食和饮水。每天观察大鼠的活动表现及中毒症状，每周称一次体重。实验末期，禁食16 h采血，禁食前和禁食后/采血前称量大鼠体重。采血时，每只大鼠摘眼球采集两份血，抗凝管全血进行血液学检查，非抗凝管血分离血清后进行血液生化检查。颈椎脱臼处死大鼠作大体解剖检查，称肝、肾、脾、心、脑、肺、睾丸/卵巢重量，计算脏器/体重比值，取心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠、睾丸/卵巢、脑、肾上腺作病理切片检查。实验数据用SPSS11.0软件进行统计处理，多组定量数据用ANOVA+SNK进行比较。

结果显示，实验期间各组大鼠未见明显异常行为和中毒症状，无死亡；各剂量组大鼠体重、增重与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。受试品对大鼠血液学指标的影响见表1，各剂量组雌、雄大鼠的血红蛋白、红细胞总数、血细胞比容、血小板总数、白细胞计数及分类与对照组比较，均无显著性差异(P>0.05)。

受试品对大鼠血液生化指标的影响见表2，连续给药28 d,各剂量组雌、雄大鼠的血液生化指标与对照组比较，无显著性差异(P>0.05)。

各剂量组受试品对大鼠禁食后体重，以及肝、肾、脾、心、脑、肺、睾丸、卵巢重量及其与体重的比值与对照组比较，无显著性差异(P>0.05)。

各剂量组大鼠尸体解剖时，肉眼检查未发现明显病变。镜下检查结果如下。肝脏：被膜完整，肝小叶结构清楚；其中对照组1只雄鼠肝细胞见点状坏死。肾脏：被膜完整，肾小球、肾小管结构正常；其中对照组1只雌鼠，高剂量组1只雄鼠肾间质见少量炎性细胞浸润。胃肠：各层结构清楚，黏膜上层完整，黏膜下层未见异常。脾脏：被膜完整，脾小梁结构正常，红白髓比例正常。睾丸：曲精管内各级生精细胞发育良好，间质未见异常。卵巢：上皮与白膜正常，各级卵泡发育良好，未见异常。肺：肺泡无扩展融合、塌陷，其中低剂量组1只雌鼠、对照组1只雄鼠、中剂量组1只雄鼠见轻度支气管肺炎。心脏：心肌纤维正常，无变形坏死，心间质未见异常。脑：脑膜正常，神经元和脑胶质细胞结构正常，无变形坏死，无肥大增生。肾上腺：皮质的球状带、束状带及网状带细胞正常，髓质细胞及中央静脉未见异常。

表1 受试品对亚急性毒性实验大鼠血液学指标的影响

Table 1 Effects of test substances on hematologic indexes in subacute toxicity test in rats

表1 受试品对亚急性毒性实验大鼠血液学指标的影响

性别组别剂量(mg/kg)血红蛋白(ρB/g·L-1)红细胞计数(×1012/L)血细胞比容血小板计数(×109/L)白细胞计数(×109/L)白细胞分类(%)淋巴细胞中性粒细胞单核细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞雄对照组144±108．44±0．290．46±0．01779±11311．66±0．4372．30±6．0221．28±5．445．00±0．921．18±0．750．02±0．01受试品组63145±58．20±0．340．44±0．03760±22311．94±2．2469．82±3．3622．28±3．056．62±1．820．86±1．040．03±0．02受试品组250144±108．48±0．270．46±0．03611±19012．05±1．3872．64±4．9520．18±4．105．86±0．791．12±1．130．02±0．01受试品组1000144±88．53±0．340．47±0．02659±7712．66±2．7372．24±8．8420．36±7．306．48±2．100．72±0．830．02±0．01雌对照组149±47．99±0．540．44±0．03749±18611．48±1．4771．56±7．0820．76±8．186．08±1．351．28±0．940．03±0．01受试品组63143±78．44±0．330．45±0．02706±10212．51±1．7171．48±4．5820．02±3．707．30±1．260．94±0．920．03±0．00受试品组250149±88．10±0．490．44±0．03751±15411．53±2．8570．66±6．6020．66±7．467．24±2．091．24±0．760．02±0．01受试品组1000148±27．86±0．310．44±0．01852±12013．67±3．7371．76±5．0320．78±6．446．20±0．971．08±0．800．02±0．01

表2 受试品对亚急性毒性实验大鼠血液生化指标的影响

Table 2 Effects of test substances on biochemical indexes in subacute toxicity test in rats

表2 受试品对亚急性毒性实验大鼠血液生化指标的影响

性别组别剂量(mg/kg)丙氨酸氨基转移酶(zB/U·L-1)天冬氨酸氨基转移酶(zB/U·L-1)总蛋白(ρB/g·L-1)白蛋白(ρB/g·L-1)胆固醇(cB/mmol·L-1)三酰甘油(cB/mmol·L-1)血尿素氮(cB/mmol·L-1)血肌酐(cB/μmol·L-1)血糖(cB/mmol·L-1)雄对照组49．66±11．20163．05±38．9468．30±3．6732．48±0．861．90±0．430．95±0．276．14±0．9458．74±6．745．18±0．31受试品组6345．32±8．18141．76±26．7066．85±1．8032．65±0．222．29±0．330．90±0．375．45±0．4259．12±2．665．48±0．66受试品组25046．58±6．68150．14±30．9565．89±4．1832．16±0．972．12±0．411．04±0．215．12±1．2756．21±3．574．91±0．37受试品组100047．10±6．90155．46±11．2467．13±0．9032．27±0．732．26±0．480．98±0．276．35±0．8659．49±1．445．49±0．14雌对照组55．16±7．39157．33±11．5965．61±3．8232．02±0．272．16±0．270．90±0．315．69±1．0357．47±2．005．04±0．31受试品组6348．92±4．59154．77±35．4064．76±3．6931．91±1．122．05±0．430．95±0．406．67±1．1058．23±3．426．10±1．22受试品组25054．40±9．80168．85±9．6863．14±0．6531．76±0．542．11±0．530．86±0．666．11±0．2856．46±4．325．65±1．06受试品组100048．72±7．90132．61±20．8064．89±2．0832．40±0．382．19±0．480．91±0．455．21±0．9257．98±2．115．99±0．27

综上所述，以1000、250、63 mg/kg剂量的受试品给大鼠经口灌胃28 d，各剂量组大鼠体重、脏器重量及脏器/体重比值与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。各剂量受试品对大鼠的血液学、血液生化各项指标未见明显影响。大鼠作大体解剖，未发现明显病变。病理切片检查结果未见与受试品有关的病理改变。提示亚急性经口毒性实验该受试品对雌、雄SD大鼠未观察到有害作用的最大剂量为1000 mg/kg。

3 讨 论

2001年6月美国FDA批准了由3M Health Care Inc药厂研制开发的一种以1%葡萄糖酸氯己定和61%乙醇(w/w)为主药，并辅以护肤成分的溶液型洗手剂，商品名Avagard,用于外科医师洗手、消毒以及医务人员洗手[1]。据此，作者也立项研制开发以1%葡萄糖酸氯己定和61%乙醇(w/w)为主药，并辅以护肤、保湿成分的木糖醇的溶液型皮肤消毒液。

葡萄糖酸氯己定是外用广谱抗菌剂及阳离子表面活性剂，与皮肤有良好亲和性，吸附并残留在皮肤表面，具有长效抗菌性能，与乙醇复配，可起到协同作用，增强杀菌效果，提高杀菌速度，高乙醇含量将微生物迅速浸湿穿透，提供了快速杀菌的先决条件[1-3]。由于含醇类，可在手清洁干燥的基础上直接进行擦拭消毒，操作更为简便，皮肤干燥速度快，减少了临床操作程序。此消毒液乙醇含量为61%，比常用浓度70%有所降低，增加了水溶液含量，使用方便(用后不用水洗)，可避免因长期使用而出现皮肤干裂、粗糙的问题。

长期频繁地使用肥皂洗手、消毒液浸泡的医护人员, 尤其是在干燥寒冷的冬季,手部皮肤长时间处于碱性状态下, 阻碍皮肤油脂层的恢复；破坏角蛋白的结构,使皮肤失去弹性,表现为皮肤干燥、粗糙,发生皲裂。在本研究中，作者采用有护肤、保湿作用的木糖醇来解决此问题。木糖醇是一种五碳糖醇，有护肤、保湿作用[4]。本品在杀灭肠道致病菌、化脓性球菌、致病性酵母菌和医院感染常见细菌的同时，还具有保护及滋润皮肤的作用。其杀菌效率高，且具长效抗菌性能；消毒过程一次性完成，方便省时；适用价值高，使用范围广；性能稳定，无毒，无刺激性，安全可靠。本消毒液配方科学, 制备工艺简单, 使用方便。本品的研制成功，将带来良好的社会效益和经济效益。

【参考文献】

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Yang HuaMing,Yi Bin.Modern hospital disinfection[M].Beijing:People’s Military Medical Press，2013：181-184.

[2]张紫虹，杨美玲，王凤岩，等. 葡萄糖酸氯己定复合乙醇消毒液杀菌效果与毒性研究[J].华南预防医学,2011,37(1):63-65.Yang ZiHong, Yang MeiLing, Wang FengYan,etal. Study on toxicity and sterilization effects of the chlorhexidine gluconate compound ethanol disinfection solution[J].South China J Prev Med,2011,37(1):63-65. In Chinese.

[3]黄淑萱，马均宝，左亚沙，等. 葡萄糖酸氯己定乙醇皮肤消毒液消毒性能观察[J].中国现代医生，2009，47(27)：187-188.

Huang ShuXuan，Ma JunBao，Zuo YaSha，etal. Observation of the disinfection properties of the chlorhexidine gluconate ethanol skin disinfection solution[J]. Chin Mod Doct，2009，47(27)：187-188. In Chinese.

[4]马永华，邱洪江. 一种含有木糖醇的化妆品保湿剂：中国，CN101444456A[P].2009-06-03.

Ma YongHua，Qiu HongJiang. A cosmetic humectant containing xylitol:China,CN101444456A[P].2009-06-03.In Chinese.