宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1、COX-2、VEGF的表达及其临床意义

袁冬兰，钱华*，王华，姜家宝，朱小蔚，焦霞，蒋小芹，肖蔚，于鸿

（泰州市人民医院1.妇产科，2.普外科，3.病理科，江苏泰州225300）

宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1、COX-2、VEGF的表达及其临床意义

袁冬兰1，钱华1*，王华1，姜家宝2，朱小蔚3，焦霞3，蒋小芹3，肖蔚3，于鸿3

（泰州市人民医院1.妇产科，2.普外科，3.病理科，江苏泰州225300）

目的：观察N-myc下游调节基因-1（N-myc downstream regulated gene-1，NDRG-1）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达，分析其在宫颈鳞状细胞癌发生发展中的作用及意义。方法：采用免疫组织化学法检测80例宫颈鳞状细胞癌患者癌组织和15例正常宫颈组织中NDRG-1、COX-2及VEGF蛋白表达情况；分析宫颈鳞状细胞癌组织中3种蛋白表达的相关性，并分析其表达与临床病理因素及患者预后的关系。结果：与正常宫颈组织比较，宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1阳性表达率明显降低（P＜0.01）；COX-2与VEGF阳性表达率明显升高（P＜0.01）。NDRG-1、COX-2及VEGF蛋白的阳性表达与宫颈鳞状细胞癌患者的年龄及肿瘤大小无关（P＞0.05），而与肿瘤组织病理学分级、FIGO分期及淋巴结转移密切相关（P＜0.01）。Kaplan-Meier生存分析显示，宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1表达阳性者生存期较长，COX-2及VEGF表达阳性者生存期较短。结论：宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1表达降低，而COX-2及VEGF表达增加，三者表达的联合检测可能对判断宫颈鳞状细胞癌的预后具有重要价值。

N-myc下游调节基因-1；环氧合酶-2；血管内皮生长因子；免疫组织化学；宫颈鳞状细胞癌

N-myc下游调节基因-1（N-myc downstream regulated gene-1，NDRG-1）是NDRG基因家族重要成员，目前已知的人源NDRG基因包括NDRG-1、NDRG-2、NDRG-3和NDRG-4，广泛分布于人体组织［1］。NDRG-1不仅与细胞增殖和分化密切相关，而且参与多种肿瘤的发生、发展、转移和血管形成过程，同时其表达受多种病理生理因素诱导调控。研究表明，多种肿瘤组织内NDRG-1表达降低或缺失，NDRG-1有望成为肿瘤基因治疗的新候选基因［2］。尽管NDRG-1的抑癌作用及机制已引起越来越多研究者的关注，但迄今为止，关于其与宫颈鳞状细胞癌关系的研究甚少。本研究采用免疫组织化学法，观察近4年部分宫颈鳞状细胞癌手术切除标本中NDRG-1、基质环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达情况，并分析其相关性和临床意义。

1 材料和方法

1.1 临床资料

选取2009年1月至2013年1月在泰州市人民医院手术切除的宫颈癌石蜡包埋标本80例，由2名高级职称病理医师阅片，证实为宫颈鳞状细胞癌。其中，高分化31例，中分化28例，低分化21例，所有标本临床资料齐备。患者年龄29～76岁，平均（49.52±8.37）岁。根据2009年FIGO标准进行临床分期，Ⅰ期32例，Ⅱ期29例，Ⅲ期15例，Ⅳ期4例。80例病例中有75例获得随访资料，随访时间为6个月至4年，平均（25.28±5.37）月。所有患者术前均未接受任何化疗、放疗和免疫治疗。另取同期经病理证实的15例正常宫颈组织作为对照，来自因子宫肌瘤或子宫腺肌症行全子宫切除术标本。

1.2 免疫组织化学染色

所有标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，2～4μm连续切片。免疫组织化学采用链霉素亲和素过氧化酶复合物法（S-P法），抗原修复采用高压锅煮5 min，DAB显色。鼠抗人NDRG-1、COX-2、VEGF单克隆抗体为丹麦Dako公司产品，工作浓度为1∶100，具体操作流程参照文献［3］，以PBS替代一抗作阴性对照。结果判断：NDRG-1与COX-2蛋白阳性信号呈黄色、棕黄色及棕褐色颗粒，定位于细胞质或细胞膜，VEGF阳性信号为细胞质内均匀黄色、棕黄色或棕褐色颗粒。根据阳性细胞数和着色强度采用半定量积分法判断结果，每张切片阳性细胞数＜5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；着色强度：黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两者积分相乘，0～4分为阴性，5～12分为阳性［4］。

1.3 统计学处理

应用SPSS 17.0软件进行统计分析，采用χ2检验分析宫颈癌组织与正常宫颈组织中NDRG-1、COX-2、VEGF表达的差异及宫颈癌组织中这3种蛋白表达与临床病理特征之间的关系。采用Spearman相关系数计算宫颈癌组织中三者之间的相关性。生存分析采用Kaplan-Meier方法统计描述生存资料，用Logrank检验方法分析生存率差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1、COX-2及VEGF的表达

正常宫颈组织中鳞状上皮NDRG-1蛋白呈阳性表达，阳性表达率为100%（15／15）；宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1蛋白阳性表达率（42／80，52.5%）及染色强度显著低于正常宫颈组织（χ2＝14.251，P＜0.01）。正常宫颈组织中鳞状上皮COX-2阳性表达率为26.6%（4／15），宫颈鳞状细胞癌组织中COX-2蛋白阳性表达率（73／80，91.2%）及染色强度均明显增加（χ2＝12.867，P＜0.01）。正常宫颈组织中鳞状上皮VEGF阳性表达率为20.0%（3／15），宫颈鳞状细胞癌组织中VEGF蛋白阳性表达率（63／80，78.7%）及染色强度均显著增加（χ2＝18.336，P＜0.01）。见图1。

图1 免疫组织化学检测NDRG-1、COX-2及VEGF的表达（S-P法×200）

2.2 NDRG-1、COX-2及VEGF的表达与患者临床病理特征之间的关系

宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1、COX-2及 VEGF的表达与患者的年龄、肿瘤大小无关（P＞0.05），而与肿瘤的组织病理分级、FIGO分期及淋巴结转移相关（P＜0.01）。见表1。

表1 宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1、COX-2及VEGF的表达与临床病理参数间的关系

2.3 NDRG-1、COX-2及VEGF在宫颈鳞状细胞癌组织中表达的相关性分析

80例宫颈鳞状细胞组织中，6例NDRG-1和COX-2同时呈阳性表达，9例同时呈阴性表达，15例NDRG-1呈阳性而COX-2呈阴性，12例NDRG-1呈阴性而COX-2呈阳性；8例NDRG-1和VEGF同时呈阳性表达，5例同时呈阴性表达，11例NDRG-1呈阳性而VEGF呈阴性，18例NDRG-1呈阴性而VEGF呈阳性；36例COX-2和VEGF同时呈阳性表达，6例同时呈阴性表达。Spearman等级相关分析显示，NDRG-1与COX-2蛋白阳性表达呈明显负相关（r＝－0.347，P＜0.01），NDRG-1与VEGF蛋白阳性表达呈明显负相关（r＝－0.157，P＜0.01），COX-2与VEGF蛋白阳性表达呈明显正相关（r＝0.254，P＜0.01）。

2.4 NDRG-1、COX-2及VEGF在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达与患者预后关系

80例宫颈癌病例中有75例获得随访资料，随访时间为6个月至4年，平均（25.28±5.37）个月。Kaplan-Meier生存分析结果显示，宫颈癌组织中NDRG-1表达阳性者较阴性者生存期长，而COX-2及VEGF表达阳性者较阴性者生存期缩短。见图2。

图2 NDRG-1、COX-2、VEGF表达与宫颈癌患者生存期之间的关系（Kap lan-Meier生存分析）

3 讨论

研究发现，多种恶性肿瘤组织（如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等）和多种肿瘤细胞株（如人结肠癌SW62细胞、人宫颈癌SiHa细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人前列腺癌ALVA细胞等）内NDRG-1表达明显降低或缺失［5］。Fotovati等［6］报道，与正常乳腺组织比较，乳腺癌组织内NDRG-1表达显著减少，高表达者生存时间较低表达者长，且其表达水平与乳腺癌的转移呈负相关，提示NDRG-1有望成为乳腺癌早期转移的分子标志。Sun等［7］观察168例胶质瘤患者术后生存率，结果显示，NDRG-1高表达者的平均生存期为23个月，低表达者为13个月，而NDRG-1阴性表达者仅为8个月，表明胶质瘤中NDRG-1表达缺失是一个预后差的独立生物学指标。

本实验结果显示，NDRG-1在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达率显著低于正常宫颈组织，证实宫颈鳞状细胞癌组织内NDRG-1异常低表达。同时，低分化宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1的表达率显著低于中分化和高分化宫颈鳞状细胞癌，FIGO分期Ⅲ、Ⅳ期宫颈鳞状细胞癌组织中的NDRG-1表达率显著低于Ⅰ、Ⅱ期，淋巴结转移组的NDRG-1表达率显著低于无淋巴结转移组，提示NDRG-1的表达与宫颈癌的分化、进展及转移有关。

COX-2作为一种诱导性即刻反应基因，是前列腺素合成的重要限速酶，在大多数正常组织中不表达，但在炎性介质、促癌因素、生长因子、癌基因的作用下表达迅速增加，促进肿瘤的形成、细胞增殖、血管生成、侵袭转移等［8］。VEGF是目前已知的最强促血管生成因子，以旁分泌或自分泌的形式与血管内皮细胞上的受体结合，促进内皮细胞分裂增殖、新生血管形成、血管通透性增高，促进肿瘤的生长与转移［9］。对宫颈癌、肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、肝癌等多种肿瘤的研究表明，VEGF高表达患者的生存期显著缩短［10］。研究显示，上调乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌细胞内NDRG-1基因的表达，瘤细胞的增殖与侵袭能力显著降低，其机制可能与NDRG-1基因抑制肿瘤细胞COX-2和VEGF的合成有关［11］。我们前期采用脂质体介导将NDRG-1基因转染宫颈癌SiHa细胞，也发现该转基因细胞增殖水平与COX-2、VEGF的表达均显著降低［12］。本实验结果显示，NDRG-1、COX-2及VEGF的表达与宫颈鳞状细胞癌组织学分级、FIGO临床分期、淋巴结转移密切相关。Kaplan-Meier生存分析结果显示，宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1表达阳性者较阴性者生存期长，而COX-2及VEGF表达阳性者较阴性者生存期缩短。同时，本实验结果表明宫颈鳞状细胞癌组织中存在NDRG-1、COX-2及VEGF的异常表达，并且三者之间的表达具有相关性，也间接提示NDRG-1可能通过参与COX-2和VEGF的合成代谢过程，进而影响宫颈鳞状细胞癌的分化、增殖及转移。因此，联合检测宫颈鳞状细胞癌组织中NDRG-1、COX-2及VEGF的表达，对于判断宫颈鳞状细胞癌患者的预后可能具有一定临床应用价值。

［1］ Tschan MP，Shan D，Laedrach J，et al.NDRG1／2 expression is inhibited in primary acute myeloid leukemia［J］.Leuk Res，2010，34（3）：393－398.

［2］ Kovacevic Z，Sivagurunathan S，Mangs H，et al.The metastasis suppressor，N-myc downstream regulated gene 1（NDRG1），upregulates p21 via p53-independent mechanisms［J］.Carcinogenesis，2011，32（5）：732－740.

［3］ 肖蔚，焦霞，赵燕，等.胰腺癌组织中Smad4、上皮型钙粘蛋白及β-连环蛋白的表达及临床意义［J］.江苏大学学报：医学版，2011，21（5）：423－427.

［4］ Fang BA，Kovacˇevic＇Ž，Park KC，et al.Molecular functions of the iron-regulated metastasis suppressor，NDRG1，and its potential as amolecular target for canc-er therapy［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1845（1）：1－19.

［5］ Kim A，Kim MJ，Yang Y，et al.Suppression of NF-κB activity by NDRG2 expression attenuates the invasive potential of highlymalignant tumor cells［J］.Carcinogenesis，2009，30（6）：927－936.

［6］ Fotovati A，Abu-Ali S，Kage M，et al.N-myc downstream-regulated gene1（NDRG1）a differentiationmarker of human breast cancer［J］.Pathol Oncol Res，2011，17（3）：525－533.

［7］ Sun B，Chu D，Li W，et al.Decreased expression of NDRG1 in glioma is related to tumor progression and survival of patients［J］.J Neurooncol，2009，94（2）：213－219.

［8］ Herrera FG，Chan P，Doll C，et al.A prospective PhaseⅠ－Ⅱtrial of the cyclooxygenase-2 inhibitor celecoxib in patients with carcinoma of the cervix with biomarker assessment of the tumor microenvironment［J］.Int JRadiat Oncol Bio1 Phys，2007，67（1）：97－103.

［9］ Yang F，Jin C，Jiang YJ，et al.Potential role of soluble VEGFR-1 in antiangiogenesis therapy for cancer［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2011，11（4）：541－549.

［10］ Goel HL，Mercurio AM.VEGF targets the tumour cell［J］.Nat Rev Cancer，2013，13（12）：871－882.

［11］ Said HM，Stein S，Hagemann C，etal.Oxygen-dependent regulation of NDRG1 in human glioblastoma cells in vitro and in vivo［J］.Oncol Rep，2009，21（1）：237－246.

［12］ 钱华，王华，袁冬兰，等.转染NDRG1基因对宫颈癌细胞COX-2、VEGF表达及增殖的影响［J］.江苏大学学报：医学版，2012，22（6）：472－475.

Expression of NDRG-1，COX-2 and VEGF in cervical squamous cell carcinoma tissue and its clinical significance

YUAN Dong-lan1，QIAN Hua1，WANG Hua1，JIANG Jia-bao2，ZHU Xiao-wei3，JIAO Xia3，JIANG Xiao-qin3，XIAOWei3，YU Hong3
（1.Department of Gynaecology，2.Department of General Surgery，3.Department of Pathology，Taizhou People′s Hospital，Taizhou Jiangsu 225300，China）

Objective：To observe the expression of N-myc downstream regulated gene-1（NDRG-1），cyclooxygenase-2（COX-2）and vascular endothelial growth factor（VEGF）in cervical squamous cell carcinoma tissue and to elucidate the mechanism of cervical squamous cell carcinoma invasion and metastasis.M ethods：Expressions of NDRG-1，COX-2 and VEGF in tissue samples from 80 cervical squamous cell carcinoma cases and 15 healthy control caseswere detected by immunohistochemistry；and their correlation with characteristics of clinicalmaterials and prognosis in cervical squamous cell carcinoma were evaluated.Results：Compared with the normal cervical tissue，the positive expression rate of NDRG-1 in cervical squamous cell carcinoma tissuewas significantly lower（P＜0.01），while the positive rate of COX-2，VEGF was higher（both P＜0.01）.There was no significant difference between positive rate of NDRG-1，COX-2，VEGF expressions and clinicopathologic data of cervical squamous cell carcinoma patients including age and tumor size（P＞0.05）.Positive expression rate of NDRG-1，COX-2 and VEGF were significant correlated with tumor histopathological grade，clinical FIGO stages and lymph nodemetastasis（P＜0.01）.There wasstatistically significant positive correlation among NDRG-1，COX-2 and VEGF expressions in cervical squamous cell carcinoma tissue（P＜0.01）.Therewas statistically correlation between positive rate of NDRG-1，COX-2 and VEGF expression with survival time by Kaplan-Meier analysis.Conclusion：The abnormal expressions of NDRG-1，COX-2，VEGFmight participate in the invasion and metastasis of cervical squamous cell carcinoma.The joint detection of NDRG-1，COX-2，VEGFmight provide some guiding significance to judge the prognosis of cervical squamous cell carcinoma.

N-myc downstream regulated gene-1；cyclooxygenase-2；vascular endothelial growth factor；immunohistochemistry；cervical squamous cell carcinoma

R737.33

A

1671－7783（2014）03－0250－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140036

江苏省六大人才基金资助项目（2011－WS－023）；泰州市人民医院重大科研资助项目（201008）

袁冬兰（1973—），女，江苏泰州人，副主任医师，硕士，主要从事妇科肿瘤研究；于鸿（通讯作者），硕士生导师，副教授，E-mail：yuhongjianglin＠163.com

*：共同第一作者

2014－02－22 ［编辑］刘星星