长链非编码RNA HOTAIR在食管鳞癌中的表达及意义

张曌玥，尹越，牟笑，吴诗，毛朝明，陈德玉

（1.江苏大学临床医学院，江苏镇江212001；2.江苏大学附属医院核医学科，江苏镇江212001；3.江苏大学附属医院放疗科，江苏镇江212001）

长链非编码RNA HOTAIR在食管鳞癌中的表达及意义

张曌玥1，尹越1，牟笑1，吴诗1，毛朝明2，陈德玉3

（1.江苏大学临床医学院，江苏镇江212001；2.江苏大学附属医院核医学科，江苏镇江212001；3.江苏大学附属医院放疗科，江苏镇江212001）

目的：研究食管鳞癌患者长链非编码RNA HOTAIR（long non-coding RNA HOTAIR，lncRNA HOTAIR）的表达、临床意义及其与转化生长因子β1（TGF-β1）间的关系。方法：实时荧光定量PCR技术检测57例食管鳞癌患者癌组织与癌旁组织中HOTAIR及TGF-β1mRNA的表达水平，分析HOTAIRmRNA表达与患者临床病理特征的关系。结果：食管鳞癌组织中HOTAIR mRNA表达较癌旁组织明显升高（Z＝－2.507，P＝0.012），TGF-β1mRNA表达明显降低（Z＝－2.038，P＝0.042）。癌组织中HOTAIR mRNA表达与肿瘤分化程度及临床分期有关，与TGF-β1mRNA表达呈负相关（r＝－0.406，P＝0.002）。结论：lncRNA HOTAIR与食管鳞癌的发生发展及其恶性程度显著相关，可能通过TGF-β1通路起作用。

HOTAIR；转化生长因子β1；食管鳞癌

长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lnc-RNAs）是一类转录本长度超过200 bp的RNA分子，本身并不编码蛋白质，而是以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多种层面上调控基因的表达水平［1］。现有的研究发现，lnc-RNAs在包括肿瘤在内的多种疾病中存在异常表达，且可能与疾病的发生发展有着密切的联系［2－5］。HOTAIR是lncRNAs的成员之一，转录本长度为2.2 kb，定位在人类12q13.13上HOXC位点，不编码任何蛋白质［6］。有研究表明，HOTAIR在原发性与转移性乳腺癌中表达上调，且其高表达与乳腺癌转移和不良预后呈正相关［7］。还有一些研究显示，HOTAIR在胃肠道间质瘤［8］、胰腺癌［9］、结直肠癌［10］、肝癌［11］、鼻咽癌［12］中高表达，并且与肿瘤的转移及不良预后有潜在关系。

多梳齿状复合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）是多梳蛋白家族基因的一员，可通过修饰染色质结构来维持基因的转录抑制。有研究表明，HOTAIR可以通过连接PRC2和组蛋白去甲基酶LSD1来沉默HOXD位点的转录［10］。而作为PRC2靶基因的细胞周期调控相关基因受转化生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）的调控。因此我们猜测，HOTAIR或许与TGF-β1间存在着某种相关性。目前仅有少数文献研究食管癌中HOTAIR的表达［13］，因此，关于HOTAIR在食管鳞癌中的表达情况及作用机制还有待进一步研究。本研究采用实时荧光定量PCR法检测HOTAIR mRNA在食管鳞癌组织中的表达，并分析其与临床病理参数间的关系，探讨其与TGF-β1间潜在的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 57例食管鳞癌组织与癌旁组织（距肿块边缘3～5 cm）均取自2012年4月至2013年5月江苏大学附属医院胸外科食管癌手术患者，术后均经病理诊断确诊为鳞癌，切缘阴性。患者年龄45～76岁，入院均行胸部X片、上消化道造影、纤维食管镜、胸部CT等检查。术前未接受任何放射或化学药物等抗肿瘤治疗。按AJCC临床分期标准：Ⅰ、Ⅱ期29例，Ⅲ、Ⅳ期28例。术后病理确诊：高、中分化43例，低分化14例。所有标本收集后迅速置－80℃冰箱保存。本实验经江苏大学附属医院伦理委员会批准，所有患者均在手术前签署书面同意书。

1.1.2 试剂和仪器 Trizol®（美国Invitrogen公司）、PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa公司）、SYBR®Premix Ex TaqTM（TaKaRa公司）、引物由美国Invitrogen公司设计合成。BIOMATE 3S紫外／可见光分光光度计（美国THERMO公司）、My Cycler梯度PCR仪（美国Bio-rad公司），Mx3000p Real Time PCR仪（美国Stratagene公司）。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 食管鳞癌与癌旁组织从－80℃冰箱取出后迅速称重，取100 mg组织，按Trizol说明书进行提取，最后用DEPC水溶解RNA。提取的RNA用分光光度计检测其浓度和纯度。

1.2.2 cDNA反转录合成 按反转录试剂盒说明书，以10μL反应体系进行cDNA反转录合成。反应条件为37℃15 min、85℃5 s，－20℃保存备用。

1.2.3 实时荧光定量PCR HOTAIR上游引物：5′-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3′，下游引物：5′-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3′，产物长度为170 bp［7］。TGF-β1上游引物：5′-CTAATGGTGGAAACCCACAACG-3′，下游引物：5′-TATCGCCAGGAATTGTTGCTG-3′，产物长度为209 bp。GAPDH上游引物：5′-TCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游引物：5′-TGGGTGGAATCATATTGGAAC-3′，产物长度为136 bp。按实时荧光定量PCR试剂盒说明书，以25μL反应体系进行扩增，阴性对照用2μL DEPC处理的超纯水代替cDNA模板。反应条件：95℃30 s 1个循环，95℃5 s，55℃20 s，40个循环。实时荧光定量PCR结果用2－ΔΔCt法进行分析。其中ΔΔCt＝ΔCt（癌组织）－ΔCt（癌旁组织）。所有实验均重复3次，取3次结果的平均值为实验结果。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，HOTAIR mRNA及TGF-β1mRNA相对表达量为非正态分布资料，计量资料以中位数（四分位数间距）表示，配对样本采用非参数Wilcoxon符号秩和检验，独立样本采用Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis检验。HOTAIR与TGF-β1相对表达量经log2正态性转换后，进行Pearson相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR产物电泳检测结果

所有标本总RNA提取后进行光密度检测，纯度较好，D（260 nm）／D（280 nm）值在1.8～2.0之间。阴性对照无扩增曲线。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测，于170 bp及209 bp处出现特异性目标条带（图1）。

2.2 实时荧光定量PCR检测结果

食管鳞癌组织中HOTAIRmRNA表达高于癌旁组织（Z＝－2.507，P＝0.012），TGF-β1mRNA表达低于癌旁组织（Z＝－2.038，P＝0.042）。见图2。

图1 HOTAIR及TGF-β1 PCR产物电泳检测结果

2.3 HOTAIR mRNA表达与食管鳞癌患者临床病理特征的关系

HOTAIR mRNA表达与肿瘤分化程度（P＝ 0.041）及患者临床分期有关（P＝0.041），与性别、年龄、肿块的部位与大小、淋巴结转移无统计学相关（P＞0.05）。TGF-β1mRNA表达与肿瘤分化程度（P＝0.010）、淋巴结转移（P＝0.041）、临床分期（P＝0.044）有关，与性别、年龄、肿块的部位与大小无统计学相关（P＞0.05），见表1。

图2 HOTAIR与TGF-β1 mRNA在食管鳞癌组织中的表达

表1 HOTARI和TGF-β1 m RNA与食管鳞癌患者临床病理特征的关系 M（QR）

2.4 HOTAIR与TGF-β1间的相关性

相关分析结果表明，在食管鳞癌组织中，HOTAIR mRNA表达与TGF-β1呈负相关（r＝－0.406，P＝0.002），见图3。

图3 食管鳞癌组织中HOTAIR与TGF-β1 mRNA表达的相关性

3 讨论

lncRNA HOTAIR是人类12号染色体HOXC基因簇的一条反义链，能募集哺乳动物PRC2（主要由H3K27me3、SUZ12、EZH2和EED组成），并将其定位于2号染色体HOXD位点，进而沉默该基因座基因转录［6－7，14］。另外，HOXD也能与CoREST／REST共抑制复合物（包含LSD1）结合［15］。因此，HOTAIR用其5′端与PRC2结合，负责H3K27甲基化，而3′端绑定LSD1复合物，介导H3K4me2去甲基化，从而沉默HOXD基因［16－17］。以上机制也分别在乳腺癌［7］、结直肠癌［10］中被验证。还有一些研究表明HOTAIR对snail蛋白［1］、PTEN［18］也有作用。因此，HOTAIR的准确机制仍有待阐明。

本研究从食管鳞癌着手，比较分析了食管鳞癌组织与癌旁组织中HOTAIR mRNA的表达情况，结果显示，与癌旁组织相比，HOTAIR mRNA在食管鳞癌组织中表达升高，且其表达随着肿瘤分化程度的降低和临床分期的进展而增高，这表明HOTAIR的高表达不仅与食管鳞癌的恶性程度有关，且可能参与了食管鳞癌的发生发展。

我们在前面提到，PRC2的靶基因同时也受TGF-β1的调控。因此我们猜测HOTAIR与TGF-β1间存在着某种相关性，从而从另一条通路来调控下游靶基因的表达。我们的结果表明，TGF-β1作为重要的肿瘤抑制物，在食管鳞癌组织中的表达要低于癌旁组织，且与肿瘤的恶性程度、临床分期、淋巴结转移均有关系。同时，相关性分析结果显示，在食管鳞癌组织中，HOTAIR mRNA表达与TGF-β1呈负相关。

TGF-β1对肿瘤的生长呈抑制作用，TGFβ／Smads信号转导通路是TGF-β1发挥生物学功能的主要通路，通路中任一元件发生突变都将会影响信号的传递，使细胞逃避TGF-β1介导的生长抑制作用，从而具有选择性生长优势，导致肿瘤的发生与发展［19］。我们的结果表明，HOTAIR很可能是通过抑制TGF-β1的生物学功能来促进食管鳞癌的发生发展，但其作用机制尚需进一步探讨和验证。

综上所述，lncRNA HOTAIR的异常高表达可能参与了食管鳞癌的发生发展，且可能是通过TGF-β1实现其对食管鳞癌组织的促进作用。下一步我们将从体内体外两方面进一步验证HOTAIR在食管鳞癌中的作用，探讨其与TGF-β1负相关的具体分子机制，希望能为食管鳞癌的发生发展机制提供一个新的思路。

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Expression and clinical significance of long non-coding RNA HOTAIR in patients w ith esophageal squamous cell carcinoma

ZHANG Zhao-yue1，YIN Yue1，MOU Xiao1，WU Shi1，MAO Chao-ming2，CHEN De-yu3
（1.School of Clinical Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Department of Nuclear Medicine，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；3.Department of Radiation Oncology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To explore the expression and clinical significance of long non-coding RNA HOTAIR（lncRNA HOTAIR）in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）and analyze its correlation with transforming growth factorβ1（TGF-β1）.M ethods：Quantitative real-time polymerase chain reaction was used to detect the expressions of HOTAIRmRNA and TGF-β1mRNA in 57 ESCC tissues and matched tumor-free tissues.The relationship between HOTAIRmRNA and clinico-pathological features of ESCCwas also analyzed.Results：In comparison tomatched tumor-free tissues，the expressions of HOTAIR mRNA（Z＝－2.507，P＝0.012）and TGF-β1mRNA（Z＝－2.038，P＝0.042）were found to be elevated and lowered，respectively，in ESCC tissues.Up-regulation of HOTAIR expression was correlated with tumor differentiation degree and clinical stage.The expression of HOTAIR was negative correlated with TGF-β1（r＝－0.406，P＝0.002）.Conclusion：lncRNA HOTAIR in ESCC tissuesmay play a significant role in the occurrence and development of ESCC through TGF-β1signaling pathways.

HOTAIR；transforming growth factorβ1；esophageal squamous cell carcinoma

R735.1

A

1671－7783（2014）03－0260－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140007

镇江市社会发展支撑计划项目（SH2011019；SH2012023）

张曌玥（1988—），女，硕士研究生；陈德玉（通讯作者），教授，主任医师，E-mail：cdeyu＠hotmail.com

2014－01－07 ［编辑］ 何承志