浅蓝菌素联合吉西他滨对人胰腺癌细胞BxPC3增殖与凋亡的影响

许春芳 许乐乐

吉西他滨是一种新型嘧啶类抗代谢药，主要作用于DNA合成期和晚G1期，并可阻止细胞由G1期进入S期，是近30年来美国食品和药物管理局(FDA)批准的第一个用于晚期胰腺癌治疗的新药。尽管吉西他滨单药方案已经成为胰腺癌辅助治疗的标准方案，但其疗效仍不能令临床医师满意，且存在的不良反应也是阻止其更广泛应用的主要原因，因此开发高效低毒的抗癌新药和采用联合化疗方案仍是临床努力的方向。本课题组前期研究[1]已证实浅蓝菌素可以有效抑制胰腺癌细胞的生长并诱导细胞凋亡。为提高对化疗药物的敏感性，本研究进一步观察浅蓝菌素联合吉西他滨是否对胰腺癌细胞的生长抑制具有协同作用，并探讨其可能的机制。

材料和方法

一、实验材料

BxPC3细胞株由第二军医大学附属长海医院馈赠。浅蓝菌素购于美国 Sigma 公司(批号 C2389)，-20℃保存，用<0.1%二甲基亚砜(DMSO)稀释成50 mg/ml原液，再用含10%胎牛血清的1640培养液稀释成所需要的浓度。吉西他滨购于美国Sigma公司，实验前用灭菌水稀释成所需要的浓度。CCK-8购自日本同仁公司。AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒购自Molecular Probes公司。Trizol购自Invitrogen公司。PCR所用试剂均购自TaKaRa公司。兔抗人Bcl-2、Bax抗体购自EPITMICE公司。鼠抗人β-actin单抗及羊抗兔和羊抗鼠二抗、细胞周期与凋亡检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。

二、实验方法

1．CCK-8法：取对数生长期BxPC3细胞，混悬于含有10%胎牛血清的1640培养液中，调整细胞密度为5×104/ml。取100 μl加入96孔板培养24 h，弃培养基，分别加入含10 μg/ml浅蓝菌素、20 μmol/L吉西他滨、10 μg/ml浅蓝菌素+20 μmol/L吉西他滨(联合)的培养液继续培养细胞24、48、72 h，以加不含药物培养液的细胞作为对照组。然后每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃孵育4 h。上酶联免疫检测仪检测每孔450 nm波长的吸光度值(A450值)，以单纯培养液的空白孔调零，计算细胞生长抑制率(IR)。IR=[1-(A450值对照组-A450值处理组)/A450值对照组]×100%。实验重复3次，取均值。

2．AnnexinV/PI双染法：BxPC3细胞培养至对数生长期，弃培养液，分别加入上述3种含药物的培养液继续培养48 h，2 000 r/min离心5 min，PBS 洗涤2次，加入500 μl Binding Buffer、5 μl AnnexinV(FITC)，混匀后加入5 μl PI，混匀，室温避光反应5～15 min，上流式细胞仪分析细胞凋亡。实验重复3次。

3. RT-PCR法：将BxPC3细胞以1×105/ml 的密度接种于培养瓶，分别加入上述3种含药物的培养液培养48 h，弃培养液，收集细胞。采用Trizol提取细胞总RNA。采用RT-PCR法检测Bax、Bcl-2 mRNA表达。Bax引物上游5′-GCGTCCACCAAGAAGCTGA-3′，下游5′-ACCACCCTGGTCTTGGATCC-3′，产物312 bp；Bcl-2引物上游5′-CAGCTGCACCTGACGCCCTT-3′，下游5′-GCCTCCGTTATCCTGGATCC-3′，产物231 bp；内参β-actin引物上游5′-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3′，下游5′-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3′，产物308 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。先逆转录为cDNA，再行PCR扩增。PCR参数：95℃ 5 min，95℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 38 s，30 个循环，最后72℃ 8 min，4℃保存。PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，紫外成像系统观察，拍照，扫描。以目的条带与内参条带的灰度值比表示mRNA相对表达量。

4．蛋白质印迹法：收集各组培养细胞，提取总蛋白。测定蛋白浓度，取20 μg常规行蛋白质印迹法检测Bax、Bcl-2蛋白表达。通过凝胶成像系统测定各条带的灰度值，以目的条带与β-actin的灰度值比表示蛋白相对表达量。实验重复3次，取均值。

三、统计学方法

结 果

一、各组BxPC3细胞增殖能力的变化

浅蓝菌素组、吉西他滨组、联合处理组BxPC3细胞的增殖抑制率均呈时间依赖性增加，且浅蓝菌素联合吉西他滨处理组具有明显的协同效应(表1)。

二、各组BxPC3细胞凋亡的变化

对照组、浅蓝菌素组、吉西他滨组、联合处理组BxPC3细胞的早期凋亡率分别为(0.83±0.31)%、(31.37±1.04)%、(38.33±0.75)%、(69.43±0.83)%，各处理组均较对照组显著增加，联合处理组又较单药处理组显著增加，各组间差异有统计学意义(F=3907.936，P<0.001，图1)。

表1 浅蓝菌素、吉西他滨及联合用药对BxPC3细胞增殖能力的影响(%，x±s)

横坐标表示AnnexinFITC，纵坐标表示PI。左上象限：允许出现的检测误差；右上象限：死亡细胞和晚期凋亡细胞；左下象限：正常细胞；右下象限：早期凋亡细胞

图1对照组(a)、浅蓝菌素组(b)、吉西他滨组(c)、联合处理组(d) BxPC3细胞凋亡图

三、各组BxPC3细胞Bcl-2、Bax mRNA表达的变化

对照组、浅蓝菌素组、吉西他滨组、联合处理组BxPC3细胞的Bcl-2 mRNA表达量分别为0.67±0.01、0.44±0.01、0.36±0.08、0.27±0.07；Bax mRNA为0.14±0.01、0.31±0.02、0.32±0.03、0.91±0.06；Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值为4.78±0.13、1.39±0.04、1.15±0.02、0.30±0.02。各处理组细胞Bcl-2 mRNA表达较对照组下降，而Bax mRNA的表达较对照组升高，Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值较对照组下降，联合治疗组又较单药处理组的变化更显著，差异均有统计学意义(F值分别为4693.227、2770.298、1853.294，P值均为0.000，图2)。

四、各组BxPC3细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的变化

对照组、浅蓝菌素组、吉西他滨组、联合处理组BxPC-3细胞的Bcl-2蛋白表达量分别为1.24±0.04、0.51±0.02、0.42±0.02、0.13±0.01；Bax蛋白表达量为0.20±0.05、0.47±0.01、0.54±0.01、1.21±0.03；Bcl-2/Bax比值为6.00±0.11、1.11±0.01、0.77±0.03、0.10±0.06。各处理组细胞Bcl-2表达均较对照组下降，而Bax表达较对照组升高，Bcl-2/Bax比值较对照组下降，联合处理组又较单药处理组的变化更显著，差异均有统计学意义(F值分别为3530.252、2914.844、12133.729，P值均为0.000，图3)。

图2 对照组(1)、浅蓝菌素组(2)、吉西他滨组(3)、联合处理组(4)细胞Bcl-2、Bax mRNA的表达

图3 对照组(1)、浅蓝菌素组(2)、吉西他滨(3)、联合处理组(4)BxPC3细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达

讨 论

胰腺癌是人类消化系统中恶性程度最高的肿瘤之一，5年生存率仅1%～4%，近年来在我国的发病率逐年上升。由于胰腺癌生长快速，早期诊断困难，因此70%～80%的患者确诊时已属晚期，失去手术机会，只能通过化疗和其他非手术治疗来缓解症状和延长生存期。目前使用的多数化疗药物效果不佳，中位生存期一般小于6个月[2]，同时不良反应较大。

吉西他滨是目前胰腺癌辅助治疗中最为常用的化疗药之一，它是细胞周期特异性抗代谢类药物，是一种嘧啶类似物，主要作用于晚G1期和S期的肿瘤细胞，可阻止癌细胞由G1期向S期的发展。它在细胞内经过核苷激酶的作用转化成活性代谢物吉西他滨二磷酸酯或三磷酸酯，竞争性抑制DNA链的延长，最终导致细胞凋亡。它还可以通过抑制DNA连接而抑制肿瘤的生长，并掩盖肽链的末端阻断DNA修复。此外，它还能增强自我抗细胞毒素的能力，在改善晚期胰腺癌相关症状方面表现出显著的疗效。10年前的一项随机对照研究比较了吉西他滨或5-氟尿嘧啶治疗晚期胰腺癌患者的疗效[3]，其中位生存期分别为5.7个月和4.2个月(P=0.00255)。基于此研究结果，吉西他滨被美国FDA批准为晚期胰腺癌的一线化疗药物，为胰腺癌的治疗带来了新的希望。然而，吉西他滨对提高疗效、 改善患者生活质量有一定优势，但是患者生存期的延长及总生存率的升高并不显著[4]，1年生存率为 18%，总生存时间为 10个月，中位生存时间约 6个月。由此可见，尽管吉西他滨单药是胰腺癌辅助化疗的标准方案，但其疗效仍不能让临床医师满意。许多研究表明，联合化疗不但能够提高抗肿瘤的效果，而且能减少抗肿瘤药物的使用剂量，从而降低药物的不良反应，提高患者化疗耐受性。鉴于吉西他滨主要通过渗入DNA链诱导细胞凋亡，因此理论上可与其他能够诱导癌细胞凋亡的抗肿瘤药产生协同作用。在众多验证吉西他滨为基础的联合方案疗效的Ⅲ期随机对照临床研究中，仅厄洛替尼联合吉西他滨、贝伐单抗联合厄洛替尼和吉西他滨2个方案可使患者得到有统计学意义的生存获益，然而其中位生存期仅延长了0.33个月[5]及1.1个月[6]。因此，在晚期胰腺癌治疗方面探索新的联合治疗模式以提高疗效一直是研究的热点。

浅蓝菌素是蓝色头孢霉的自然代谢产物，能够有效地抑制脂肪酸合酶的合成，抑制多种肿瘤细胞的生长、增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡，抗瘤机制广泛而复杂。实验研究发现浅蓝菌素在乳腺癌细胞株(包括雌激素依赖的乳腺癌细胞株MCF-7、ZR-75-1，非雌激素依赖的乳腺癌细胞株SKBR3、MDA435)及小鼠移植瘤模型实验中抑制细胞生长，诱导细胞凋亡[7-8]。Lawrence等[9]用浅蓝菌素作用于膀胱癌细胞株T2，发现浅蓝菌素对其具有明显的抑制作用。同样，Okawa等[10]研究发现浅蓝菌素具有抗多发性骨髓瘤的作用。尽管浅蓝菌素抗肿瘤的作用可能因肿瘤类型和细胞株的不同而有所差异，但根据本课题组前期的实验结果可见浅蓝菌素对胰腺癌细胞株BxPC3的增殖生长有很强的抑制作用，并且能诱导BxPC3细胞凋亡，阻滞细胞于S期，并阻止细胞由S期进入G2期[11]，而吉西他滨主要阻止癌细胞由G1期向S期的发展，抑制DNA合成。因此设想浅蓝菌素与吉西他滨联合用药对人胰腺癌细胞株BxPC3可能具有协同作用。

根据本课题前期实验计算出浅蓝菌素IC50为10 μg/ml，本研究选择浅蓝菌素为10 μg/ml与吉西他滨20 μmol/L联合处理BxPC3细胞。结果发现，与对照组相比，单药处理组和联合用药组肿瘤细胞的增殖活性均得到有效抑制，但联合组表现出更加显著的协同抑制效应，差异具有统计学意义。本研究结果还显示浅蓝菌素与吉西他滨均能促进BxPC3细胞的早期凋亡，但联合组具有更明显的促早期凋亡作用，且晚期凋亡率也明显增加。

Bax、Bcl-2是线粒体途径上游的凋亡调控基因，在细胞的凋亡中起着非常重要的作用。其中，Bcl-2是细胞凋亡抑制基因，Bax是细胞凋亡促进基因，Bax/Bcl-2的比值影响细胞凋亡的发生，是肿瘤发生的决定因素[12-13]。本研究结果显示，浅蓝菌素、吉西他滨处理胰腺癌BxPC3细胞48 h后，Bcl-2 mRNA及蛋白表达减少，Bax mRNA及蛋白表达增加，联合作用组的效应更明显。由此可见浅蓝菌素与吉西他滨具有协同效应，其作用机制可能是二者联合后使Bcl-2基因表达进一步下调，Bax基因表达进一步上调，从而使抑制胰腺癌BxPC3细胞增殖的作用明显增强，并促进细胞凋亡。

参 考 文 献

[1] Jemal A,Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2007[J]. CA Cancer J Clin, 2007, 57(1):43-66.

[2] Sener SF, Fremgen A, Menck HR, et al. Pancreatic cancer: a report of treatment and survival trends for 100 313 patients diagnosed from 1985-1995, using the National Cancer Database[J]. J Am Coll Surg, 1999,189(1):1-7.

[3] Burris HA, Moore MJ, Andersen J, et al. Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therepy for patients with advanced pancreas cancer：a randomized trial[J]. J Clin Oncol, 1997, 15(6):2403-2413.

[4] Brennan MF.Adjuvant therapy following resection for pancreatic adenocarcinoma Surg[J]. Oncol Clin N Am, 2004, 13(4):555-566.

[5] Moore MJ, Goldstein D, Hamm J, et al. Erlotinib plus gemcitabine compared with gemcitabine alone in patients with advanced pancreatic cancer:a phase Ⅲ trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group[J]. J Clin Oncol, 2007, 25(5): 1960-1966.

[6] Van Cutsem E, Vervenne WL, Bennounal J, et al. Phase Ⅲ trial of bevacizumab in combination with gemcitabine and erlotininb in patients with metastatic pancreatic cancer[J]. J Clin Oncol, 2009, 27(13): 2231-2237.

[7] Pizer ES, Jackisch C, Wood FD, et al. Inhibition of fatty acid synthesis induces programmed cell death in human breast cancer cells[J]. Cancer Res, 1996, 56(12): 2745-2747.

[8] Pizer ES, Wood FD, Heine HS, et al. Inhibition of fatty acid synthesis delays disease progression in a xenograft model of ovarian cancer[J]. Cancer Res, 1996, 56(6): 1189-1193.

[9] Lawrence DS, Zilfou JT, Smith CD, et al. Structure-activity studies of cerulenin analogues as protein palmitoylation inhibitors[J]. J Med Chem, 1999, 42(24): 4932-4941.

[10] Okawa Y, Hideshima T, Ikeda H, et al. Fatty acid synthase is a novel therapeutic target in multiple myeloma[J]. Br J Haematol, 2008, 141(5):659-671.

[11] 许乐乐，许春芳.浅蓝菌素对人胰腺癌细胞株BxPC-3的影响及机制[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2013,7(19):8739-8744.

[12] Jo EH, Hong HD, Ahn NC, et al. Modulation of the Bcl-2/Bax family were involved in the chemopreventive effects of licorice root (Glycyrrhiza uralensis Fisch) in MCF-7 human breast cancer cell[J]. J Agric Food Chem, 2004, 52(6):1715-1719.

[13] Cory S, Adams JM. Killing cancer cells by flipping the Bcl-2/Bax switch[J]. Cancer Cell, 2005, 8(1):5-6.