硫氧还蛋白-2在急性坏死性胰腺炎大鼠肺的表达及意义

赵晖 钟卫一 韦惠琴 黄滟添

硫氧还蛋白-2(thioredoxin-2, Trx-2)是存在于细胞线粒体的一种氧化还原蛋白，研究显示Trx-2在阻止线粒体氧化应激方面较Trx-1更具重要作用[1]。为此，本研究检测Trx-2在急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肺的表达，探讨Trx-2在对抗肺氧化应激方面的作用。

一、材料与方法

1．实验动物及分组：健康雄性SD大鼠48只,清洁级,体质量200～250 g，由广西医科大学实验动物中心提供。所有大鼠造模前禁食12 h，自由饮水。按完全随机法分成ANP组和对照组，每组各24只。采用腹腔注射6%左旋精氨酸(Sigma公司)25 ml/kg体质量、每次间隔1 h、共3次的方法制备ANP模型。对照组大鼠则腹腔注射等容积生理盐水。术后6 、12 、24 h分别处死8只大鼠，留取动脉血、胰腺和肺组织标本待测。

2．胰腺和肺组织病理学检查：胰腺和肺组织常规固定、石蜡包埋、切片及HE染色。光镜下观察大鼠胰腺病理改变,参考Kusske等[2]的标准进行评分。

3．血清谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)测定：GSH、MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按说明书操作。

4．Trx-2表达检测：采用Elivison二步法检测肺组织Trx-2表达。兔抗鼠多抗购自北京生物合成及生物技术公司，工作浓度1∶200；生物素化羊抗兔二抗来自即用型免疫组化Elivision plus广谱试剂盒。以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知表达Trx-2的乳腺癌组织作为阳性对照。应用Leica图像分析系统进行定量灰度扫描，求出给定面积内的灰度值。染色愈深、灰度值愈小，则表示蛋白表达愈强。

二、结果

1．胰腺及肺组织病理变化：对照组大鼠胰腺肉眼观无明显变化；镜下见胰腺腺泡结构完整，腺小叶清晰，偶见水肿或少量炎性细胞浸润。ANP组大鼠胰腺外观呈灰白或暗紫色，腹腔内有淡黄色或血性腹水，可见部分腹腔脏器粘连、脂肪皂化；镜下见胰腺腺泡水肿，炎性细胞浸润，组织坏死出血，腺小叶结构消失，偶见灶状或大片凝固性坏死，并随时间延长而加重(表1)。

对照组大鼠肺脏肉眼观无明显变化；镜下见肺组织结构完整，偶见水肿或少量炎性细胞浸润。ANP组大鼠镜下见肺泡出血、水肿，间质出血、水肿，炎性细胞浸润，毛细血管淤血，甚至出现灶性或片状肺不张，并随时间延长而加重(表1)。

2．血清GSH、MDA水平的变化：ANP组大鼠血清GSH水平随时间延长而逐渐下降，各时点均较对照组显著降低，差异有统计学意义；ANP组血清MDA水平随时间延长而逐渐上升，各时点均较对照组显著升高，差异有统计学意义(表1)。

表1 两组大鼠各指标的比较

3．肺组织Trx-2表达的变化：ANP组6、12 h的肺组织Trx-2表达强度与对照组差异无统计学意义，24 h点表达强度显著增高，与对照组的差异有统计学意义(表1、图1) 。

图1 对照组(1a)、ANP组(1b) 24 h点肺组织Trx-2表达(免疫组化×100)

讨论硫氧还蛋白是一个广泛分布的氧化还原蛋白，通过二硫化物活性中心可逆地催化许多氧化还原反应，参与机体多种生物学活动，目前发现的Trx有Trx-1、Trx-2、Trx-14和Trx-80。研究表明，Trx-1和Trx-2过量表达协同阻止多种炎性因子(TNF、ROS、ASK1)诱导的细胞死亡[3]。最近研究揭示，线粒体在细胞凋亡信号转导中发挥关键作用，而Trx-2在参与线粒体介导的凋亡途径、阻止线粒体膜的去极化、维持膜电位等方面较Trx-1更有效[1]。它们对氧化应激保护作用的差异可能是与其表达部位不同有关。Trx-2在线粒体中表达，而Trx-1在细胞质中表达，因此，Trx-2可以直接阻止线粒体膜的去极化[4]。Umasuthan等[5]研究表明，Trx-2是一种针对抗菌反应的强效抗氧化剂。

与Trx-1比较，Trx-2的结构存在一个额外的N-末端结构域，它包含两个高度保守的CXXC( Cys Xaa Xaa Cys)氨基酸序列结构，这两个CXXC结构紧密协调一个锌原子，组成锌中心，氧化时锌被释放，通过释放锌引发主要构象变化，发挥氧化还原开关的作用[6]。Trx-2锌结合蛋白的特点是锌极端的亲和力，它远远高于已报道的其他锌结合蛋白的亲和常数，因此，这种锌结合蛋白显得更加稳定[7]。Ritz等[8]研究显示，体内氧化应激早期时，所有Trx-2的半胱氨酸处于还原状态，并不反映活性氧的存在。他们认为Trx-2功能可相当于Trx-1 ，在氧化应激条件下可能作为一个备份系统发挥作用。

本课题组先前的研究结果显示，在ANP早期肺组织Trx-1表达即显著升高[9]。本结果显示Trx-2在肺组织的表达在早期并不升高，而在晚期随着氧化应激反应的加重(表现为血GSH持续降低，MDA持续升高)时才显著升高，与Ritz等[8]的结果相一致，表明Trx-2可能作为一个备用系统参与肺的氧化应激反应。Trx-2在氧化应激的早期表达不高，除与Trx-2锌结合蛋白极端亲和力的特征外，还可能与Trx-1表达增高,减少氧化应激有关[10]。

参 考 文 献

[1] Sugano E, Murayama N, Takahashi M, et al. Essential role of thioredoxin 2 in mitigating oxidative stress in retinal epithelial cells[J].J Ophthalmol,2013,185825.

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[3] Tournier C, Hess P, Yang DD, et al. Requirement of JNK for stress-induced activation of the cytochrome c-mediated death pathway[J]. Science, 2000,288(5467): 870-874.

[4] Sugano E, Isago H, Murayama N，et al.Different anti-oxidant effects of thioredoxin 1 and thioredoxin 2 in retinal epithelial cells[J].Cell Struct Funct, 2013,38(1):81-88.

[5] Umasuthan N, Revathy KS, Lee Y, et al.Mitochondrial thioredoxin-2 from Manila clam (Ruditapes philippinarum) is a potent antioxidant enzyme involved in antibacterial response[J]. Fish Shellfish Immunol, 2012,32(4):513-523.

[6] Collet JF, D′Souza JC, Jakob U, et al. Thioredoxin 2, an oxidative stress-induced protein, contains a high affinity zinc binding site[J].J Biol Chem,2003,278(46):45325-45332.

[7] Hunt JA, Fierke CA. Selection of carbonic anhydrase variants displayed on phage. Aromatic residues in zinc binding site enhance metal affinity and equilibration kinetics[J].J Biol Chem,1997,272(33):20364-20372.

[8] Ritz D, Patel H, Doan B, et al. Thioredoxin 2 is involved in the oxidative stress response in Escherichia coli[J].J Biol Chem, 2000,275(4):2505-512.

[9] 牛桂军,唐国都,梁志海,等. 硫氧还蛋白-1在急性坏死性胰腺炎大鼠肺组织中的表达褪黑素干预的影响[J].世界华人消化杂志, 2010,18(6):550-556.

[10] Zhang H, Du Y, Zhang X, et al. Glutaredoxin 2 Reduces Both Thioredoxin 2 and Thioredoxin 1 and Protects Cells from Apoptosis Induced by Auranofin and 4-Hydroxynonenal[J]. Antioxid Redox Signal, 2014,21(5):669-681.