机械张力诱发小鼠增生性瘢痕的实验研究

温从吉 傅士博 周仁鹏 王丹茹

皮肤损伤后，纤维组织过度增生会形成增生性瘢痕，表现为隆起的红色瘢痕，伴有慢性的炎症反应，严重影响外观，并可引起局部功能受限。增生性瘢痕的生理病理机制尚未完全清楚[1]，缺少有效的治疗及预防手段。张力对增生性瘢痕的形成具有重要作用。增生性瘢痕的好发部位，如前胸部、肩部、肩胛区部及耻骨弓上方等，均系日常活动中持续或间断地处于张力环境下[2]。减少创面局部张力，可一定程度上抑制瘢痕增生及病理性瘢痕的复发[3]。目前，常用的方法有弹力衣、硅胶膜及减张胶布等[4]。但由于动物皮肤与人类存在较大的不同，目前的研究尚缺少有效的增生性瘢痕动物模型，无法在细胞及分子水平进行深入研究。2007年，Aarabi等[5]在小鼠背部皮肤模拟人类皮肤的张力环境形成了增生性瘢痕，类似于人类瘢痕，并能维持6个月以上。因此，我们研究该动物模型，以验证该模型的有效性，及其是否可持续而稳定表达增生性瘢痕特征。

1 材料和方法

1.1 实验动物

4周龄C57/BL6小鼠(中科院上海动物实验中心)，20只，体质量28±2 g，随机分为两组(n=10)。

1.2 实验方法

小鼠麻醉下在背部纵向切开2 cm，6-0尼龙线缝合，4 d后拆线。创面以6-0尼龙线安装牵拉装置，实验组于术后第4天开始牵拉，距离2 mm，之后隔天牵拉4 mm，至第14天；对照组安装后不牵拉(图1)。

图1 机械牵拉装置Fig.1Mechanical traction device

1.3 大体观察

14 d后拆除装置，牵引结束后1 d、30 d、60 d、90 d观察小鼠瘢痕生长情况，包括面积、颜色和质地。

1.4 组织学观察

牵引后1 d、30 d、60 d切取瘢痕组织，即刻4%多聚甲醛固定，脱水、透明、浸蜡、包埋，于瘢痕最凸起部位横断切片(厚度为5 μm)，分别行HE和MASSON染色。

1.5 瘢痕面积测量

瘢痕面积根据瘢痕横断面HE染色数字图像进行测量，随机选取5个切片标本，采用Image Pro-Plus 6.0软件进行分析，取平均值。

1.6 瘢痕细胞数目变化及胶原量变化情况

取牵引后1 d、30 d、60 d各时间段HE染色标本，100倍视野下取5个区域，使用Image Pro Plus 6.0标记，并统计细胞核数目，取平均值(细胞数/区域)。切片MASSON染色，胶原组织染成蓝色，取各时间段组织标本，400倍视野下随机选取5个区域，Image Pro Plus 6.0软件统计胶原比例(创面胶原/正常组织胶原×100%)。

1.7 统计学分析

应用SAS 8.1软件包进行数据统计学分析和处理，实验数据以±s表示，不同时间点组间比较采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观及瘢痕面积

通过14 d的机械牵引，小鼠背部创面可见明显的瘢痕组织(4.09±0.31 mm2)，轻度隆起于皮肤表面，色红，质硬；牵引后30 d，瘢痕面积(3.5±0.2 mm2)较前缩小(P0.5)，瘢痕周围新生毛发组织生长旺盛；牵引后60 d，瘢痕面积(1.52±0.12 mm2)进一步缩小(P0.5)。牵引后90 d，瘢痕部位布满毛发，中间隐约可见手术切口，瘢痕面积1.42±0.18 mm2。对照组去除装置后当天及牵拉后30 d瘢痕面积未见明显改变(1.50±0.18 mm2vs 1.46±0.19 mm2，P0.5)(图2、3)。

图2 大体外观图Fig.2Gross images

图3 瘢痕面积变化趋势Fig.3The area changes of loaded scars over time

2.2 组织学观察

实验组牵引后1 d创面新生表皮明显增厚，局部增厚的表皮组织向下生长，疑似有毛囊的再生(图4)，肉膜组织切口处中断，创面中央新生胶原组织填充，胶原中间布满细胞，新生组织含新生血管组织较多；牵引后30 d，肉膜组织断裂，表皮较前明显变薄，瘢痕中央未见毛囊及皮脂腺等皮肤附属器，胶原组织与表皮平行，毛细血管组织丰富，细胞数目较前减少，未见明显的漩涡状胶原结节；牵引后60 d，瘢痕组织的面积明显缩小，但瘢痕中央部分胶原增粗且排列紊乱，两侧被含有毛囊新生组织替代。对照组术后30 d切口下方肉膜组织断裂，但表皮及真皮组织完全愈合，未见明显平行于表皮的纤维组织(图5)。

图4 牵引后1 d可见新生毛囊(MASSON染色)Fig.4Regenerative hair follicle was observed 1 days after traction by MASSON staining

图5 组织学图像Fig.5Histological images

2.3 瘢痕组织细胞数目及胶原变化

牵引后1 d，镜下见组织内布满细胞(317±20个/区域)，胶原纤维主要为细而短的小纤维(0.1±0.02)；牵引后30 d，发现胶原数量明显增多，胶原纤维平行皮肤表面，细胞数目(165±13个/区域)较前明显较少(P0.5)；牵引后60 d；瘢痕部位细胞数目及胶原含量接近正常皮肤(73±11个/区域vs 80±10个/区域，P0.5)(0.95±0.09 vs 1±0.01，P0.5)(图6)。

3 讨论

由于对增生性瘢痕纤维增殖过程的病理机制尚不明了，目前的治疗效果不理想。大量证据表明，张力跟增生性瘢痕有着密切联系[3]，我们在小鼠皮肤创面愈合早期给予机械张力刺激，14 d的持续牵拉后发现，形成的瘢痕在外观和组织学上都符合人增生性瘢痕的特征，且在其后的60 d中可持续维持增生性瘢痕特征。

正常小鼠的皮肤跟人类皮肤解剖结构相差甚远，其皮肤松弛，布满毛发，创面形成后，皮下肉膜组织牵拉周围皮肤向创面中央聚拢，促进创面愈合，且愈合后几乎不留痕迹。因此，必须借助牵拉装置对老鼠创周皮肤施加张力，才能模拟人类皮肤的张力环境[6]，促使其形成瘢痕。给予张力刺激的时机是决定瘢痕形成效果的重要因素，如果在创面未完全愈合时，也就是还处于炎症早期给予张力，会影响创面愈合，只有在重新上皮化即炎症期后期施加张力才会产生增生性瘢痕，并且持续牵拉时间必须达到7 d以上才可能形成增生性瘢痕[5]。在持续牵拉14 d后，我们通过HE及MASSON染色发现，形成的瘢痕为增生性瘢痕，瘢痕组织内未见有明显的毛囊及皮脂腺等皮肤附属器，并且瘢痕组织明显隆起于正常组织，色红，质硬，且其后的2个月中瘢痕组织依旧可以维持上述特征。此外，我们还发现，瘢痕组织面积逐渐缩小，且被含有毛囊的新生组织占据。

哺乳动物的毛囊作为复杂的微型器官，一直被认为是不可再生的。但是，有研究认为，兔子、小鼠皮肤在创伤后，毛囊有完全再生的能力[7]。因为缺乏足够证据，该观点一直无法得到广泛认可。Ito等[8]研究发现，正常的成年小鼠毛囊缺失后可重新生成，再生的毛囊拥有正常毛囊干细胞，表达毛囊结构分化标志，并产生毛发，拥有毛囊正常的生长周期。有研究证明，机体免疫作用是创面愈合过程中的重要因素，表皮γδT细胞可以分泌Fgf-7(成纤维生长因子)、Fgf-10和IGF1(胰岛素样生长因子)，对角化细胞的存活、增殖及迁移有着重要作用[9]。Gay等[10]研究发现，当降低Fgf-7表达时，会减少创面诱导的毛囊再生；相反，当过表达Fgf-7时，新生毛囊则有2～3倍的增加，并且发现γδT细胞分泌的Fgf－7可引发wnt的表达，增强了创面成纤维细胞wnt的活性，而激活的成纤维细胞也表达Fgf-7，放大了真皮损伤后的wnt信号，促进皮肤毛囊的再生。但是，人类皮肤真皮严重缺少定居γδT细胞，创伤后不能诱导毛囊再生。本实验中，小鼠的瘢痕组织面积缩小，被含有新生毛囊的正常组织替代，且接近于正常皮肤，验证了小鼠毛囊可以再生，同时表明毛囊的再生对小鼠的瘢痕修复有着重要作用。

综上所述，本实验中的动物模型在术后60 d内可形成增生性瘢痕，且符合人增生性瘢痕特征；但因为创面诱发毛囊再生，使得瘢痕组织面积缩小，不能长期存在。

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[3]Ogawa R,Akaishi S,Huang C,et al.Clinical applications of basic research that shows reducing skin tension could prevent and treat abnormal scarring:the importance of fasical/subcutaneous tensile reduction sutures and flap surgery for keloid and hypertrophic scar reconstruction[J].J Nippon Med Sch,2011,78(2):68-76.

[4]Al-Attar A,Mess S,Thomassen JM,et al.Keloid pathogenesis and treatment[J].Plast Reconstr Surg,2006,117(1):286-300.

[5]Aarabi S,Bhatt KA,Shi Y,et al.Mechanical load initiates hypertrophic scar formation through decreased cellular apoptosis[J].FASEB J,2007,21(12):3250-3261.

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