麻痹性贝毒素电喷雾质谱负离子模式分析特征

李兆永，陈军辉，王 帅，张茹潭，史 倩，2，郑 立，王小如,3

(1. 国家海洋局第一海洋研究所，海洋生态研究中心，山东 青岛 266061；2. 中国海洋大学化学化工学院，山东 青岛 266100；3. 厦门大学化学化工学院，福建 厦门 361005)

麻痹性贝毒素电喷雾质谱负离子模式分析特征

李兆永1，陈军辉1，王 帅1，张茹潭1，史 倩1，2，郑 立1，王小如1,3

(1. 国家海洋局第一海洋研究所，海洋生态研究中心，山东 青岛 266061；2. 中国海洋大学化学化工学院，山东 青岛 266100；3. 厦门大学化学化工学院，福建 厦门 361005)

利用多级质谱技术对8种常见麻痹性贝毒素(GTX1, GTX 4, GTX2, GTX 3, dcGTX2, dcGTX3, C1和C2)在电喷雾质谱负离子模式下的分析特征进行研究。结果表明:8种目标化合物在一级质谱分析过程中均易失去1个H，形成准分子离子[M-H]-峰(基峰)；在二级质谱分析过程中，各化合物的母离子([M-H]-)主要通过丢失-H2O和-NHCO等中性碎片，形成稳定的特征子离子峰，并且同分异构体的二级质谱图有差异，可为含硫麻痹性贝毒素的二级质谱定性、定量分析提供依据。此外，对各目标化合物二级质谱的主要碎片峰进行三级质谱分析，对产生的主要特征碎片峰进行归属，并推测裂解途径。本研究可为电喷雾质谱在负离子模式下检测含硫麻痹性贝毒素提供参考和依据。

麻痹性贝毒素；电喷雾质谱；裂解途径

麻痹性贝毒素(paralytic shellfish poisoning, PSP)是赤潮毒素中毒性最大、发生毒害事件最多、影响人类最为严重的一类毒素，食入少量的PSP毒素即可引起神经系统疾病，严重时会导致呼吸系统麻痹，甚至死亡[1]。麻痹性贝毒素是四氢嘌呤的衍生物，没有紫外吸收，易溶于水，但不溶于非极性有机溶剂[2]。据最新统计，现已发现的PSP毒素有20多种，根据分子结构中R4基团的不同，可将其分为4类：1)氨基甲酸酯类毒素(carbamate toxins)，包括石房蛤毒素(STX)、新石房蛤毒素(neoSTX)、膝沟藻毒素1-4(GTX1-4)；2)N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)，包括B1-2、C1-4；3)脱氨甲酰基类毒素(decarbamoyl toxins)，包括dcSTX、dcneoSTX、dcGTX1-4；4)脱氧脱氨甲酰基类毒素(deoxydecarbamoyl toxins)，包括dodcSTX、dodcGTX2、3等[3]。

近年来，液相色谱-电喷雾质谱联用技术已成为海产品和藻体中PSP检测的先进方法之一。采用电喷雾质谱检测PSP的现有文献均为正离子(ESI+)模式，存在方法灵敏度低的缺点[4-10]。而采用电喷雾质谱负离子模式检测PSP毒素的研究未见报道，负离子模式下的PSP质谱分析裂解规律也尚未阐明。在已经发现的20多种PSP毒素中，约有65%PSP毒素含有OSO3-基团，对于含有此基团的化合物而言，理论上更适合ESI负离子模式检测。本研究分别采用ESI+和ESI-两种模式，对含OSO3-基团的8种常见的PSP毒素：PSPGTX1、4(R4=COONH2)，GTX2、3(R4=COONH2)，dcGTX2、3(R4=OH)和C1、2(R4=COONHSO3-)(均为同分异构体)进行分析比较，在负离子模式下进行多级质谱裂解规律研究，并对其碎片峰进行归属，以期为液相色谱-电喷雾质谱法(ESI-模式)测定含S麻痹性贝毒素提供依据。

这种微服公访的有效性已经见之于各地的工作实践。诸如广东省在“打伞”惩恶时，省、市、县三级的纪委监委暗访组分兵行动，拍摄了大量的黑恶势力的视频现场和百姓的控诉，为快刀斩乱麻地扫黑除恶提供了铁证。专项斗争第一轮督导的其他省、区、市，用类似的工作方法获得了当地黑恶势力对无辜百姓刀捅电击、镐把断腿等残忍迫害行径的一手材料，获得了黑恶势力广布耳目、操纵选举的一手材料，获得了黑恶势力盗墓掘坟、偷运文物的一手材料，获得了黑恶势力非法拘禁、涉枪涉爆的一手材料，让各种黑恶势力及其“保护伞”感到末日已近。

在农村水利领域，分别针对农田节水与灌溉、大型灌区泵站改造、农村饮水安全及农村小水电等，引进95项技术，创新转化产品120项，实现国产化仪器和设备36项，开发软件22套，集成系统21个，取得专利17项，成果在249个工程中得到成功应用，有效促进了农村水利发展，对新农村建设起到了积极的推进作用。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

1200型高效液相色谱仪：美国Agilent公司产品，配有四元泵、DAD检测器、自动进样器等；6320型离子阱质谱仪：美国Agilent公司产品，配有电喷雾(ESI)离子源；Milli-Q超纯水处理系统：美国Millipore公司产品。

2组患者术后1周和末次随访时Cobb角较术前均明显改善，差异有统计学意义（P ＜ 0.05，表2）。术前和术后1周Cobb角2组间相比差异无统计学意义（P ＞ 0.05），末次随访时B组Cobb角显著小于A组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05，表2）。末次随访时，B组Cobb角丢失1.22°±0.34°，A组丢失5.62°±1.16°，差异有统计学意义（P ＜ 0.05，表2）。

在各化合物一级质谱分析的基础上，以准分子离子[M-H]-峰为母离子，进行ESI-MS2分析，结果示于图2。下面将对各PSP同分异构体的二级质谱分析特征进行逐一讨论。GTX1和GTX4的ESI-MS2分析主要得到m/z367、349子离子峰。m/z367子离子峰均为基峰，推测为准分子离子m/z410的R4基团失去中性碎片-NHCO而形成的[M-H-43]-子离子峰。由于m/z367子离子峰丰度高、稳定性好，故在GTX1&4定量分析中可选为定量离子。推测m/z349的子离子峰为母离子失去中性碎片-H2O-NHCO而形成的[M-H-61]-子离子峰。通过比较GTX4与GTX1的二级质谱图可以看出，在GTX4的二级质谱图中还可观察到明显的m/z392子离子峰，推测为母离子12位C失去一分子水所生成的[M-H-18]-子离子峰。由此可知，在ESI-二级质谱分析中，GTX4母离子比GTX1更易产生稳定的失水峰，这可作为区分这对同分异构体的质谱特征指标。

1.2对照品溶液的配制

用0.1 mol/L 乙酸稀释毒素标准溶液，配成混合标准储备液，各组分的浓度分别为：GTX1(0.124 mg/L)、GTX2(0.226 mg/L)、GTX3(0.086 mg/L)、GTX4(0.041 mg/L)、dcGTX2(0.205 mg/L)、dcGTX3(0.046 mg/L)、C1(0.270 mg/L)和C2(0.083 mg/L)。

1.3亲水作用色谱-电喷雾质谱条件

1.3.1色谱条件 Waters Atlantis HILIC Silica色谱柱(2.1 m×150 mm×3 μm)；流动相：A为水，B为95%乙腈(含有5 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸)；流速0.4 mL/min；进样量10 μL；室温20～25 ℃；梯度洗脱程序：时间为0—5—33—35 min，B%为100%—100%—89.8%—80%。

1.3.2质谱条件 负离子模式(ESI-)，扫描范围m/z100～500，干燥气温度350 ℃，干燥气流速10 L/min，喷雾气压241.3 kPa，毛细管电压4.5 kV，裂解电压120 V，锥孔电压60 V。

2 结果与讨论

2.1PSP毒素ESI-MS，ESI-MS2质谱分析特征

GTX2和GTX3在ESI-MS2分析中主要得到m/z376、351、333子离子峰，分别为准分子离子m/z394失去中性碎片-H2O，-NHCO和-H2O-NHCO所形成的子离子峰。在GTX2的二级质谱图中，m/z351的子离子峰为基峰，子离子峰m/z376，333丰度均较低；而GTX3的二级质谱图与GTX2差异明显，其中m/z376子离子峰为基峰，m/z351、333子离子峰丰度也相对较高。这两种化合物(同分异构体)在二级质谱分析中检测到的子离子差异明显，可用于该化合物的区分。GTX2定量离子可选用m/z394>m/z351，而GTX3的定量离子可选用m/z394>m/z376。

麻痹性贝毒素标准溶液(CRM-GTX1&4-c，CRM-GTX2&3-c，CRM-dcGTX2&3-c，CRM-C1&2等)：加拿大国家海洋研究中心产品。

甲酸(色谱纯)和甲酸铵(优级纯)：瑞士Fluka公司产品；乙腈(色谱纯)：美国Tedia公司产品；超纯水：由Milli-Q超纯水系统制得。

图1 负离子模式下8种PSP毒素一级质谱图Fig.1 MS spectra of eight PSP toxins in negative ion mode

分别采用ESI+和ESI-全扫描对8种常见含OSO3-基团的PSP标准溶液进行检测，结果发现，这8种PSP化合物(两两为同分异构体)在正、负离子模式下均有响应，但是在负离子模式下的灵敏度明显好于正离子模式，灵敏度约为正离子模式的2～10倍。8种常见含OSO3-基团PSP毒素在负离子模式下的一级质谱图示于图1。由图1可见：8种PSP化合物在负离子模式下均易失去1个H，形成准分子离子[M-H]-峰(基峰)，各化合物m/z分别为GTX1和GTX4：410，GTX2和GTX3：394，dcGTX2和dcGTX3：351，C1和C2：474；在一级质谱检测过程中未发现[2M-H]-峰，且[M-H]-峰稳定性较好，一级质谱图上未见明显的碎片峰，各组同分异构体的一级质谱图并无明显差异。

dcGTX2和dcGTX3在ESI-MS2分析中主要得到m/z333子离子峰(基峰)，推测为准分子离子m/z351的12位C上失去一分子水，可选用m/z351>m/z333作为检测离子，用于dcGTX2和dcGTX3的定量测定。比较dcGTX2和dcGTX3的二级质谱图可以发现，两者有一定的差异，可通过二级质谱分析对二者进行区分。

5) 远程维护：当需要对变电站防误数据进行维护时，无需在变电站进行维护，调控中心工作站可实现对五防系统内任一变电站防误数据远程维护工作，避免维护滞后性，降低数据更新备份工作量。

C1和C2在ESI-MS2分析中主要得到m/z456、351、431、413、394的子离子峰。基峰为m/z456子离子，推测为母离子12位C上失去一分子水，可选用其作为检测子离子进行C1和C2的定量测定。子离子峰m/z351推测为母离子R4基团失去碎片-SO3-NHCO；m/z431子离子峰推测为母离子失去中性碎片-NHCO，进一步失去一分子水生成m/z413碎片峰；m/z394子离子峰推测为母离子失去碎片-SO3形成的子离子峰。

图2 负离子模式下8种PSP毒素二级质谱图Fig.2 MS2 spectra of eight PSP toxins in negative ion mode

摘 要：在小学教学的过程中，语文是教师比较重视的学科之一。开展阅读教学能够有效培养学生的文学素养，提升学生的语文实践能力以及综合能力。但是对于学生来说，由于其自身的思维、分析能力还不成熟，所以阅读教学的难度较高。因此，在具体的教学过程中，教师可以借助信息技术开展阅读教学，激发学生的阅读兴趣，从而提升其综合能力。

2.2PSP毒素ESI-MS3质谱分析及裂解规律

在多级质谱分析中，对子离子信号强度影响最大的是碎裂振幅。如果碎裂振幅过高，母离子完全碎裂；如果碎裂振幅过低，母离子没有碎裂或子离子碎片过少，不便对化合物进行结构鉴定[11]。以各目标化合物在ESI-MS2分析中得到的丰度最大的离子峰为三级质谱分析母离子，通过逐渐加大碎裂振幅，比较不同碎裂振幅条件下的三级质谱图，从而确定最佳的三级质谱分析条件，8种化合物的三级质谱图示于图3。

从图3可以看出，GTX1和GTX4三级质谱图均主要得到m/z349离子，推测为m/z367离子峰失去一分子H2O所生成m/z349离子峰。GTX2和GTX3三级质谱图都得到m/z333离子峰，但裂解途径不同；GTX2为m/z351离子峰失去一分子H2O生成m/z333离子峰；GTX3为m/z376离子峰失去中性碎片-NHCO生成m/z333离子峰。dcGTX2和dcGTX3 ESI-MS3质谱图主要得到m/z253、235、274离子峰，为m/z333离子峰分别失去-SO3、-SO3-H2O、-NH3-HNCNH所生成；dcGTX2的m/z333离子峰还可失去-NH3生成m/z316离子峰，失去-HNCNH生成m/z291离子峰；而dcGTX3的三级质谱图中并无m/z316和m/z291离子产生。C1和C2三级质谱图均得到m/z413、376、333离子峰，为m/z456离子峰分别失去-NHCO、-SO3、-SO3-NHCO所生成，C1的m/z413离子峰还可失去一分子水生成m/z395碎片峰，C2无碎片m/z395离子生成。

图3 负离子模式下8种PSP毒素三级质谱图Fig.3 MS3 spectra of eight PSP toxins in negative ion mode

通过比较各化合物结构和多级质谱信息发现：GTX1～GTX4多级质谱分析碎片峰较少，均可失去中性碎片-NHCO和-H2O，三级质谱峰均为失去碎片-NHCO-H2O所形成，且丰度较高，说明子离子[M-H-43-18]-结构相对比较稳定。而dcGTX2和dcGTX3二级质谱分析得到的基峰恰为结构稳定的m/z333离子峰，其它二级碎片离子较少。dcGTX2、dcGTX3、C1、C2的三级质谱分析碎片离子较多，丰度都很低，且这4种化合物都可失去-SO3中性碎片。8种化合物多级质谱分析产生的碎片离子列于表1，推测得出的各化合物多级质谱分析裂解途径示于图4。

表1 8种麻痹性贝毒素多级质谱分析数据

3 结论

采用电喷雾质谱在负离子模式下测定8种常见含硫PSP毒素，其灵敏度明显高于正离子模式，离子稳定性较好，且能提供较丰富的碎片信息。8种含硫PSP毒素在负离子模式一级质谱分析过程中均易失去1个H，形成准分子离子[M-H]-峰(基峰)，且同分异构体的一级质谱图无明显差异；在二级质谱分析过程中,各PSP毒素的母离子([M-H]-)主要通过丢失-H2O和-NHCO的中性碎片，形成稳定的特征子离子峰，并且同分异构体的二级质谱图有差异。GTX1～GTX4的三级质谱分析碎片峰较少，三级质谱基峰均为失去碎片-NHCO-H2O所形成，且丰度较高。dcGTX2、dcGTX3、C1、C2的三级质谱分析碎片离子较多，丰度很低，且这4种化合物都可失去-SO3中性碎片。在此基础上，对这8种含硫PSP毒素的多级质谱分析裂解途径进行了推测，其结果可为电喷雾质谱负离子模式定性、定量分析常见含硫PSP毒素提供依据。

图4 8种PSP毒素质谱分析裂解途径Fig.4 Fragment pathways of eight PSP toxins for MS analysis

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MSCharacteristicofParalyticShellfishPoisoningToxinsDetectedbyElectrosprayIonizationMassSpectrometryinNegativeIonMode

LI Zhao-yong1, CHEN Jun-hui1, WANG Shuai1, ZHANG Ru-tan1, SHI Qian1,2, ZHENG Li1, WANG Xiao-ru1,3

(1.ResearchCenterforMarineEcology,TheFirstInstituteofOceanography,SOA,Qingdao266061,China; 2.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,OceanUniversityofChina,Qingdao266100,China; 3.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,XiamenUniversity,Xiamen361005,China)

The MS characteristic of eight common paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins (GTX1, GTX4, GTX2, GTX3, dcGTX2, dcGTX3, C1 and C2) were investigated by electrospray ionization multi-stage mass spectrometry (ESI-MSn) in negative ion mode. The results show that the quasi-molecular ion peak [M-H]-(base peak) of each PSP toxin is detected by ESI-MS. Stability characteristic fragment ions are observed by the neutral loss of -H2O and -NHCO for ESI-MS2detection， and the MS2spectra of PSP toxin isomers are different, which can provide experimental basis for qualitative and quantitative determination of sulfur containing PSP toxins by ESI-MS2. ESI-MS3detection is performed for the main characteristic fragment ions of the target toxins produced during ESI-MS2analysis. The main MS3characteristics of the fragment routes are also discussed. This study can help to offer the reference and basis for determination of sulfur containing PSP toxins by electrospray ionization mass spectrometry in negative ion mode.

fragmentation pathway; electrospray mass spectrometry; paralytic shellfish poisoning

2013-05-24；

：2013-07-02

国家高技术研究发展计划(863)项目(2007AA092001-10)；国家科技支撑计划项目(2013BAK12B00)；上海市科委科研计划项目(11dz1204706)资助

李兆永(1984～)，男(汉族)，山东人，助理工程师，环境科学专业。E-mail: lizhaoyong2056@126.com

陈军辉(1978～)，男(汉族)，河北人，副研究员，海洋化学专业。E-mail: jhchen@fio.org.cn

O 657.63

：A

：1004-2997(2014)01-0008-08

10.7538/zpxb.2014.35.01.0008