β-内酰胺类抗生素质谱裂解机理研究

郭泽琴，霍佳丽，王建华，吴志军

(1. 重庆大学生物工程学院, 重庆 400044；2. 中国科学院成都生物研究所, 四川 成都 610041)

β-内酰胺类抗生素质谱裂解机理研究

郭泽琴1，霍佳丽1，王建华1，吴志军2

(1. 重庆大学生物工程学院, 重庆 400044；2. 中国科学院成都生物研究所, 四川 成都 610041)

采用电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF-MS/MS)对3种头孢类和2种青霉素类药物的[M+Na]+裂解规律进行研究。头孢类药物[M+Na]+裂解可产生许多互补的碎片离子，1,3-H重排和retro-Diels-Alder (RDA)是其重要的裂解方式；青霉素类药物[M+Na]+裂解除了一些常规的中性分子丢失外，在氘代实验的基础上提出了比以往更合理的H2S丢失途径，即1,5-H重排。本实验丰富了β-内酰胺类药物的质谱裂解途径，对应用质谱技术快速鉴定复杂体系中β-内酰胺类抗生素具有重要作用。

β-内酰胺类抗生素；电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF-MS/MS)；裂解规律；氢重排

β-内酰胺类药物是使用最早的一类抗生素，在临床和畜牧业中被广泛用于疾病的预防和治疗。在速成养殖中，β-内酰胺类药物作为饲料添加剂可以促进牲畜的生长[1-8]，但该类药物在食用动物组织中容易残留。随着抗生素的过度使用，动物体内抗生素残留量增加，长期食用含有β-内酰胺类抗生素残留的食品，可对人体造成严重的危害[2-4]。因此，需要一种快速、有效的方法对食品中β-内酰胺类抗生素进行有效的检测和监控。

质谱分析具有检测速度快、灵敏度高和样品耗费少等优点，已成为复杂体系中痕量成分分析的一种重要方法[18-19]。质谱鉴定工作的可靠性需要丰富的带有结构信息的碎片离子来保证。对质子加合的β-内酰胺类药物的质谱研究已有一些报道，其主要的裂解方式为β-内酰胺环和碳氮键的断裂[8-17]，但关于该类抗生素钠加合离子[M+Na]+的断裂方式却未见报道。本工作利用高分辨电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱 (ESI-Q-TOF-MS/MS)法研究5种具有代表性的β-内酰胺类药物(包括3种头孢类药物和2种青霉素类药物) [M+Na]+的断裂方式，其结构式示于图1，并且利用氘代实验对其断裂机理进行验证。

注：1.头孢克洛；2.头孢拉啶；3.头孢羟氨苄；4.氨苄西林；5.阿莫西林图1 5种β-内酰胺类抗生素的结构式 Fig.1 The structure of five kinds of β-lactam antibiotics

1 实验部分

1.1主要仪器和装置

microTOF Q质谱仪：德国Bruker公司产品，配有电喷雾(ESI)离子源，Compass 数据处理系统，自动进样器。

1.2试剂和样品

β-内酰胺类抗生素对照品：美国Sigma-Aldrich公司产品；甲醇(色谱纯)：美国Fisher Scientific公司产品；质谱校正液：美国Agilent公司产品；实验用水：自制超纯水；氘代试剂D2O和CD3OD：美国CIL公司产品；氘代溶液配制：分别取0.1 mg头孢克洛(1)、头孢拉定(2)和氨苄西林(4)于2 mL D2O中，放置24 h。

1.3质谱条件

电喷雾(ESI)离子源；ESI源电压-500 V；毛细管电压-4 500 V；雾化气体：高纯氮气；雾化气压力30 kPa；进样速度180 μL/h；干燥气温度180 ℃；干燥气流速4.0 L/min；在正离子模式下先进行一级质谱全扫描，m/z100～3 000，再选择[M+Na]+离子进行二级质谱分析。

2 结果与讨论

2.1头孢类抗生素1～3的[M+Na]+MS/MS分析及裂解规律研究

对头孢克洛(1)[M+Na]+m/z390进行二级质谱分析，可以得到丰富的碎片离子峰，示于图2，其主要碎片离子组成列于表1。互补离子对m/z213和m/z200为β-内酰胺环断裂产生的离子峰，m/z213再丢失一分子NH3生成m/z196；互补离子对m/z257和m/z156由[M+Na]+发生RDA反应产生中间体m/z390经氨交换和四元环氢重排而得到，m/z257再脱去一分子NH3得到m/z240，该中间体也可经酯化反应和麦氏重排[20]生成m/z231，或直接发生自由基断裂生成m/z230；互补离子对m/z285和m/z128由[M+Na]+经1, 3-H重排而得到，前者再经RDA反应，进一步断裂生成m/z124，其裂解途径经氘代实验得到验证，示于图2b。头孢克洛(1) [M+Na]+可能的断裂过程示于图3，化合物2、3[M+Na]+的裂解途径与化合物1相似，示于图4。

注：a.[M+Na]+二级质谱图；b.[M/D+Na]+ 二级质谱图；c.氘代试验一级扫描图图2 头孢克洛(1)[M+Na]+ m/z 390的二级质谱图Fig.2 Product ion scan of the selected precursor [M+Na]+ at m/z 390 for cefaclor (1)

表1 头孢克洛(1)主要碎片离子的组成

图3 头孢克洛(1) [M+Na]+ 可能的断裂过程Fig.3 Major fragmentation patterns of [M+Na]+ for cefaclor (1)

图 4 头孢拉啶(2) [M+Na]+ 的二级质谱图Fig.4 Product ion scan of the selected precursor [M+Na]+ for cefradine (2)

2.2青霉素类抗生素4～5的[M+Na]+MS/MS分析及裂解规律研究

氨苄西林4[M+Na]+m/z372的MS/MS图示于图5，其主要碎片离子组成列于表2。例如，互补离子对m/z267和m/z128由m/z372经1, 3-H重排而得到。m/z372可丢失一分子CO产生m/z344，后者再脱去一分子CO2和H2S产生m/z266；还可连续脱去一分子NH3，CO2和H2S生成m/z277，其中H2S易通过1, 5-H重排而脱去，氨苄西林(4) [M+Na]+可能的断裂过程示于图6，该裂解途径经氘代实验得以确证(图5b)，并且从氘代裂解图中可以推断出S元素是以DHS或D2S的形式丢失的。阿莫西林(5) [M+Na]+的裂解途径与氨苄西林(4)相似，其二级质谱图示于图7。

与[M+H]+相比，β-内酰胺类药物的[M+Na]+裂解途径更丰富，可产生酰胺交换，四氢重排，1, 3、1, 5-H重排以及RDA反应等裂解途径。可能的原因是质子化位点不同，在质谱中H+倾向于与氮结合发生电荷诱导裂解，而Na+更倾向于与氧结合。

注：a.[M+Na]+二级质谱图；b.[M/D+Na]+二级质谱图； c.氘代试验一级扫描图图5 氨苄西林(4)m/z 372的二级质谱图 Fig.5 Product ion scan of the selected precursor [M+Na]+ at m/z 372 for ampicillin (4)

表2 氨苄西林(4)主要碎片离子的组成

3 结论

本实验采用高分辨ESI-Q-TOF-MS/MS在正离子模式下对5种β-内酰胺类抗生素[M+Na]+二级质谱的裂解规律进行分析研究,并在氘代实验的基础上，解释了这类化合物的裂解过程，提出了1, 3、1, 5-H重排以及RDA反应等裂解机理，丰富了离子化学机理,为使用质谱技术快速鉴定复杂体系中非目标β-内酰胺类药物提供了理论基础。

图6 氨苄西林(4) [M+Na]+ 可能的断裂过程Fig.6 Major fragmentation patterns of [M+Na]+ for ampicillin (4)

图7 阿莫西林(5) [M+Na]+ 的二级质谱图Fig.7 Product ion scan of the selected precursor [M+Na]+ at m/z 388 for amoxicillin (5)

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StudyontheCleavageRuleofβ-LactamAntibioticsbyElectrosprayQuadrupoleTime-of-FlightTandemMassSpectrometry

GUO Ze-qin1, HUO Jia-li1, WANG Jian-hua1, WU Zhi-jun2

(1.CollegeofBioengineering,ChongqingUniversity,Chongqing400044,China; 2.ChengduInstituteofBiology,ChineseAcademyofSciences,Chengdu610041,China)

The fragmentation of sodiated molecules [M+Na]+of five kinds ofβ-Lactam antibiotics, including three cephalosporins and two penicillins, were studied by electrospray quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry (ESI-Q-TOF-MS/MS). For cephalosporins, besides the cleavage of active tetracycle, 1, 3-H rearrangement and retro-Diels-Alder reaction (RDA) played the substantial roles in the production of many informative product ions, and the D-labeling experiments supported the postulated mechanisms.The processes of sequential losses of a CO2and H2S molecule from the precursor sodiated molecules for penicillins possibly involving 1, 5-H rearrangement were elucidated and further confirmed by D-labeling experiment. This work enriches the fragmentation ofβ-lactam antibiotics and will be valuable for the rapid identification of untargetedβ-lactam antibiotics in the complicated matrix by mass spectrometry.

β-lactam antibiotics; electrospary quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry (ESI-Q-TOF-MS/MS); fragmentation mechanisms; H rearrangement

2013-04-10；

：2013-07-01

郭泽琴(1989～)，女(汉族)，安徽人，硕士研究生，药物分析专业。E-mail: guozq1008@163.com

王建华(1962～)，男(汉族)，安徽人，教授，从事药物合成与分析和药物制剂工程研究。E-mail: wjh@cqu.edu.cn 吴志军(1979～)，男(汉族)，湖南人，青年研究员，从事药物质谱分析与测试研究。E-mail: wuzj@cib.ac.cn

O 657.63

：A

：1004-2997(2014)01-0045-07

10.7538/zpxb.2014.35.01.0045