香菇C91-3转录本Unigene 14872基因Pkinase结构域的克隆表达及其生物信息学分析

杜忠娟，钟民涛，伦永志，刘 奔，张 伟，王晓丽，李星云，曹 靖，宁安红，黄 敏*

(1.大连医科大学微生物教研室，辽宁大连 116044;2.大连大学医学院，辽宁大连 116622)

香菇是最著名的食用菌之一，具有很高的营养及药用价值。近几十年来，国内外学者对其进行了大量的研究，并证明香菇具有抗衰老、保肝降酶、抗肿瘤、抗感染和免疫调节作用［1-4］。本课题组经多年研究筛选得到了香菇C91-3菌株，首次发现其发酵蛋白具有良好的诱导肿瘤细胞凋亡作用［5-7］。为开发应用香菇C91-3菌株抗肿瘤蛋白成分，寻找表达这些蛋白的基因序列，基于功能基因组学，首次通过solexa高通量转录组从头组装测序技术，对香菇菌C91-3的转录组进行了测序工作，获得转录组Unigene序列，然后借助生物信息学工具进行其表达谱的分析比对，成功获得香菇C91-3的转录组中大量的Unigene及其功能注释信息。其中Unigene为28 923条，具有编码框的Unigene有18 120条［8］。根据注释信息，结合香菇C91-3蛋白诱导肿瘤细胞凋亡机制的特点，成功筛选克隆并在毕赤酵母表达体系表达出抗肿瘤蛋白24414［9］，继续采用同样的方法筛选出Unigene 14872基因序列(以下简称14872)。本研究目的是根据Unigene 14872基因序列设计引物，用3'-Full RACE、5'-Full RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法获得基因全长，然后进行PCR扩增，PCR产物与载体连接、转化，构建重组质粒，并诱导Unigene 14872基因的蛋白表达，初步鉴定其抗肿瘤活性，为进一步研究重组蛋白的活性及作用机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验试剂 总RNA提取Trizol试剂盒，3'-Full RACE Core Set Ver 2.0、5'-Full RACE Kit、BigDye Terminater V3.1购自invitrogen公司;Cycle Sequencing Kit、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒及实验所需各种引物、酶类均购自宝生物工程(大连)有限公司;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(XGal)购自TIANGEN公司。酵母提取物、胰蛋白胨购自OXOID公司。

1.1.2 实验设备 低温离心机(Eppendorf，德国)，PCR 扩增仪(TaKaRa Thermal Cycler TP600，TaKaRa BIO INC.)，核酸电泳仪(Mupid，ADVANCE-BIO Co.，Ltd)，凝胶成像分析系统(北京六一实验仪器厂)，紫外分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)。

1.1.3 质粒和菌株 克隆载体pMD-19-T Simple Vector购自TaKaRa(大连)公司，表达载体pET32a(+)为本实验室保存，宿主大肠埃希菌DH5α为本实验室保存，用于质粒扩增，宿主菌JM109购自TaKaRa(大连)公司。

1.2 方法

1.2.1 Unigene14872基因的筛选 对香菇C91-3的转录组中大量的Unigene基因进行功能注释，成功筛选出Unigene 14872基因。

1.2.2 香菇C91-3菌株总RNA提取与引物设计取综合马铃薯培养基培养15 d的香菇菌C91-3的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，用Trizol试剂盒按说明一步法提取总RNA，将所得总RNA溶于50 μL DEPC水中。引物设计采用Oligo 6.0设计软件，根据转录组测序结果，设计合成3'-RACE、5'-RACE实验所需特异性引物。实验所需引物序列见表1。

表1 引物序列Table1 Primers used in the experiment

1.2.3 3'-Full RACE反应和5'-Full RACE反应应用3'-Full RACE Core Set Ver 2.0、5'-Full RACE Kit试剂盒。将3'-Full RACE反应和5'-Full RACE反应获得的基因片段拼接并送宝生物(大连)公司测序。

1.2.4 Unigene 14872基因全长的生物信息学分析 通过DNASTAR软件包对核酸的编码产物进行分析。再通过Blast对Unigene 14872蛋白序列与NCBI数据库检索同源性的蛋白序列进行比对，分析其同源性和功能。

1.2.5 亚克隆目的基因Unigene 14872中 Pkinase结构域 ①引物设计与合成:根据Unigene 14872中Pkinase的核苷酸序列设计PCR反应引物，并委托宝生物(大连)公司合成，引物序列见表1;②反转录:使用TaKaRa 3'-Full RACE Core Set Ver.2.0(Code No.D314)合成cDNA。反应体系:香菇菌丝体Total RNA 1 μg，3'RACE Adaptor(5 μmol/L)，dNTP Mixture(10 mmol/L each)各1 μL，RNase Free dH2O Up to 7.5 μg。反应条件:70℃，10 min，立即冰上放置2 min。然后加入下列组分:5×M-MLV Buffer 2 μL;RNase Inhibitor(40 U/μL)，Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(200 U/μL)各0.25 μL，Total 10 μL。反应条件:42℃，60 min;70℃，15 min;③PCR扩增:使用PrimeSTARⓇHS DNA Polymerase(Code No.DR010S)，进行PCR扩增。反应条件:98℃ 10 s，55℃ 10 s，30个循环;70℃ 1 min，72℃ 5 min。PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，再经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。

1.2.6 重组表达质粒的构建及鉴定 用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切pET32a(+)载体，经胶回收纯化载体后，与同样双酶切的目的片段连接，转化JM109，涂布于相应抗性平板，挑选阳性菌落植菌，提取质粒命名为pET32a(+)-Pkinase。用LB液体培养基加入相应的抗生素分别培养含有pET32a(+)-Pkinase质粒的阳性菌种。用质粒提取试剂盒按照说明书提取质粒，用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切，然后分别取5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.2.7 重组蛋白的诱导表达及鉴定 重组表达质粒转化进入E.coliRosetta-gami(DE3)感受态细胞，同时设立阴性对照，挑取阳性单菌落接入含有相应抗生素的LB液体培养基，37℃、120 r/min振荡培养过夜，取1 mL培养液转接于含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃、120 r/min振荡培养至OD600为0.5～0.8时，向培养物中加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，于37℃继续诱导培养3 h，4℃离心收集细菌。少部分菌体用于SDS-PAGE电泳和Western blot检测目的蛋白的表达，另外部分菌体经4℃离心取沉淀用于目的蛋白纯化。

1.2.8 重组蛋白活性的鉴定 将纯化、复性并浓缩后的目的蛋白进行微量BCA蛋白定量后，用MTT法检测细胞存活和生长情况。将目的蛋白作用的终浓度分别调整为3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL，以RPMI-1640作为空白对照。评价其对肿瘤细胞的细胞毒作用。用人肺癌A549细胞进行MTT实验。用0.25%～1%胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×104～10×104/mL。每孔加入100 μL，边缘孔用无菌PBS 填充，5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔板)加入上述3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL，浓度梯度的药物每孔100 μL，每个浓度设6个复孔，5%CO2，37℃孵育24、48 h。并倒置显微镜下观察，然后每孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，继续培养4 h。终止培养，弃去孔内培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10 min。在酶标仪492 nm处测量各孔的吸光值，参考波长630 nm，按照下面公式计算抑瘤率(细胞生长抑制率):IR(inhibited rate)=(对照组平均OD值－实验组平均OD值)/对照组平均OD值×100%。

2 结果与分析

2.1 Unigene 14872基因全长的获得

按照方法1.2获得3'-Full RACE和5'-Full RACE基因片段，再进行1%琼脂糖凝胶电泳(如图1)进行验证。将3'-Full RACE和5'-Full RACE获得的基因片段拼接，经测序Unigene 14872基因全长为2 325 bp。

2.2 序列全长的生物信息学分析结果

经使用NCBI数据库核苷酸相似性检索表明，无任何相似性的基因序列，证明此基因为一新型基因。同时再经NCBI数据库氨基酸相似性检索(如图2)，Unigene 14872蛋白具有Pkinase结构域，Pkinase结构域所对应的核酸序列为810 bp，该结构域具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等多种生物学功能。

图1 RACE结果Fig.1 The result of RACE

图2 Unigene 14872氨基酸序列在NCBI数据库blast结果Fig.2 The result of Unigene 14872 amino acid sequence blast in NCBI database

2.3 目的基因的获得

按照方法1.2.4获得Pkinase结构域目的基因，再进行1%琼脂糖凝胶电泳(如图3)进行验证。

2.4 重组表达质粒的构建及鉴定结果

培养连接并转化好的大肠埃希菌JM109宿主菌，按照方法1.2.6，提取质粒进行酶切验证，1%的琼脂糖凝胶电泳检测(如图4)。

2.5 重组蛋白的诱导表达及鉴定

表达的样品进行SDS-PAGE和Western-blot，结果见图5和图6。图5中显示，与阴性对照相比较，经IPTG诱导的全细胞液中显现了1条多出的蛋白质条带，分子量约为50 ku，比理论计算值29.7 ku大，这是由于表达载体pET32a(+)上的编码序列能合成约16～20 ku的蛋白质，所以得到的总蛋白质量约为45～50 ku。图6中显示，与阴性对照相比较，经IPTG诱导的全细胞液中显现了1条特异的蛋白质条带，分子量约为50 ku。SDSPAGE和Western blot结果表明，诱导表达出的蛋白为目的蛋白，可以继续进行下一步纯化目的蛋白。

图5 表达产物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of expression products

图6 表达产物的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of expression products

2.6 重组蛋白的抗肿瘤活性

按照方法1.2.8，用MTT 法检测重组蛋白的活性，结果见图7。

图7 目的蛋白对A549细胞的MTT检测结果Fig.7 The MTT result of the expressed protein to A549

3 讨论

为开发香菇C91-3与抗肿瘤相关的功能基因，本研究利用提取的香菇C91-3菌株菌丝体总RNA反转录成cDNA，然后通过3'-Full RACE反应和5'-Full RACE反应拼接获得Unigene 14872基因全长为2 325 bp。并用NCBI中Blast比对，对基因全长进行分析，发现Unigene 14872蛋白具有Pkinase结构域，所对应的核苷酸序列为810 bp。以Pkinase的核苷酸序列作为模板进行PCR扩增;由PCR扩增后电泳检测结果看到样品有一条810 bp的清晰条带，浓度较高，扩增条件适宜，所得到的扩增产物可以进行回收纯化。通过重组表达质粒的构建，将目的基因成功连接到表达载体pET32a(+)中。同时将重组好的表达质粒转化到大肠埃希菌JM109宿主菌保存，质粒测序结果与Blast比对结果一致，进一步证明重组表达质粒构建成功。

Pkinase在结构上是含有具有催化功能的蛋白激酶结构域，Pkinase是一组酶，在蛋白质的磷酸基团上移动，使蛋白质在细胞内发生磷酸化。该功能作为一个开/关开关，用于许多细胞过程，包括代谢、转录、细胞周期进展、细胞骨架重排、细胞运动、细胞凋亡、分化。它们也存在于胚胎发育、生理反应、神经系统和免疫系统中。异常磷酸化导致许多人类疾病，包括癌症，影响磷酸化的药物可以治疗这些疾病［10］。我们已成功克隆、表达出了Unigene 14872的Pkinase结构域。通过MTT法初步检测出重组蛋白对人肺癌A549细胞有显著地抑制作用，其作用机制有待于进一步研究。

［1］Guo-Qing Zhang，Ying-Ying Wu，Tzi-Bun Ng，et al.A Phytase Characterized by Relatively High pH Tolerance and Thermostability from the Shiitake MushroomLentinus edodes［J］.BioMed Research International，2013，10:1155-1161.

［2］O.M.Tsivileva，V.E.Nikitina，E.A..Loshchinina Isolation and characterization ofLentinus edodes(Berk.)singer extracellular lectins［J］.Biochemistry，2008，73(10):1154-1161.

［3］P.V.Jeurink，C.L.Noguera，H.F.J.Savelkoul，et al.Wichers Immunomodulatory capacity of fungal proteins on the cytokine production of human peripheral blood mononuclear cells［J］.International Immunopharmacology，2008，8(8):1124-1133.

［4］V.P.Rincao，K.A.Yamamoto，N.M.Ricardo，et al.Polysaccha-ride and extracts from Lentinula edodes:structural features and antiviral activity［J］.Virology Journal，2012，9:37.

［5］戴兵，黄敏.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究［J］.浙江医学，2004，26(9):656-658.

［6］张健，黄敏，宁安红，等.LFP91-3对小鼠腹水瘤细胞端粒酶及腹水碱性磷酸酶、胆碱酯酶活性影响的研究［J］.中华实用医药杂志，2004，4(19):1729-1731.

［7］董晓宇，刘庆平，曹婧，等.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抗肿瘤免疫机制［J］.肿瘤学杂志，2006，1(12):64-66.

［8］Mintao Zhong，Ben Liu，Xiaoli Wang，et al.De novo characterization ofLentinula edodesC91－3transcriptome by deep Solexa sequencing［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2013，431(1):111-115.

［9］刘奔，钟民涛，王晓丽，等.香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS15中的表达与鉴定［J］.中国微生态学杂志，2012，24(2):161-165.

［10］G.Manning，D.B.Whyte，R.Martinez，et al.The Protein Kinase Complement of the Human Genome［J］.Science，2002，298(5600):1912-1934.