ST－1菌株对致病疫霉抑制作用的初步研究*

吴艳清，张 映，王 颖

(保定学院生化系，河北 保定 071000)

致病疫霉是鞭毛菌亚门卵菌纲霜霉目卵菌，生理分化明显，可引起番茄和马铃薯的晚疫病，是严重危害农作物生长的重要植物病原微生物［1］。目前在生产中除利用有限的抗病品种外，主要依赖于化学农药来防治晚疫病，但化学农药的长期使用已导致致病疫霉抗药性逐渐增强、环境污染日益严重。而利用拮抗微生物控制该病具有无污染、不易使有害生物产生抗药性等特点，使许多学者对拮抗微生物的研究有更多的注意。

放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强的原核生物。放线菌广泛地分布在含水量较低、有机物较丰富和呈微碱性的土壤中。已有研究表明放线菌能够生产出许多重要的活性物质，已经从放线菌的次生代谢产物中筛选出许多新的生化药物［2］，从土壤中筛选出对致病疫霉抑制作用明显的放线菌是研究的一大方向。

研究表明，有些学者已经筛选出一些对致病疫霉菌丝生长和孢子萌发具有显著抑制作用的拮抗真菌、放线菌和细菌［4］。本实验从土壤中分离纯化出拮抗致病疫霉的放线菌，并研究其发酵液对致病疫霉的抑制作用。为今后开发田间有效控制马铃薯晚疫病的高效、稳定的生物农药提供理论依据，对马铃薯晚疫病的有效控制也具有重要的指导意义和参考价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 使用仪器

JA2002电子天平(上海精天电子仪器有限公司);SW－CJ－2F净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司);BXW－30R立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);LRH－250G光照培养箱(广东省医疗器械厂);LRH－250A生化培养箱(广东省医疗器械厂);HH－S数显恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂);电热鼓风干燥器(上海一恒科学仪器有限公司);IS－RDD3恒温振荡器(泰山市鑫达气弹簧有限公司)

1.1.2 试剂

试剂:黑麦、可溶性淀粉、75%酒精、蔗糖、琼脂、无菌水、KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4、FeSO4。

1.2 实验材料

1.2.1 供试材料

试验采用ST－1菌株从土壤中筛选，致病疫霉由河北大学生命科学学院植物病理研究室惠赠。

1.2.2 供试培养基配方

本实验用到了三种培养基:

高氏 I号培养基:可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，琼脂 20g，水1000mL，pH7.2 －7.4。

高氏 I号液体培养基:可溶性淀粉 20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，Fe-SO40.01g，水 1000mL，pH7.2 －7.4。

黑麦培养基:黑麦65g，琼脂16g，蔗糖20g，水1000mL。

1.3 方法步骤

1.3.1 放线菌ST－1的分离纯化

从石家庄深泽县采集土样，自然风干后称取10g土样放入盛有90ml无菌水三角瓶中，振荡20min，用移液管吸取1ml加入盛有9ml无菌水的试管中制成10－1土壤稀释液，以此类推制成 10－2、10－3、10－4、10－5、10－6几个梯度的土壤悬浮液。利用稀释涂布平板法涂布在高氏I号培养基上对放线菌进行分离纯化，将分离纯化的放线菌在28℃光照培养箱恒温培养5－7天，利用显微镜观察菌落的形态、色泽、有无气生菌丝、色素产生情况等初步鉴定为放线菌［1－3］，并对分离出的一株放线菌编号为ST－1。在高氏I号培养基上对ST－1菌株进行纯化，将纯化的ST－1菌株放在4℃冰箱保存备用。

1.3.2 ST－1菌株对致病疫霉抑制作用测定

进一步筛选不同DPPC与甘露醇质量比（1∶1、1∶2、1∶3）的白藜芦醇DPPC脂质粉雾剂处方，通过对外观、流动性和载药量综合比较，选择甘露醇与DPPC质量比为2∶1，作为粉雾剂最优处方（图2）。

利用对峙培养法测定。将活化好的致病疫霉用灭菌后的打孔器打取直径13mm的菌饼并接种于黑麦培养基中央，将活化好的ST－1菌株用灭菌后的打孔器打取直径9mm的菌饼并接种于致病疫霉菌饼两侧，使两个ST－1菌株分别与致病疫霉菌株相距15mm。重复三次。以空白的致病疫霉菌饼为对照，做三组对照。20℃生化培养箱培养6－8天，观察致病疫霉的生长情况，并计算抑菌率。

图1:ST－1菌株对致病疫霉抑制效果

抑菌率(%)=(对照菌落半径－处理菌落半径)/对照菌落半径*100

1.3.3 ST－1菌株发酵液对致病疫霉抑制作用的测定

制备ST－1菌株发酵液。将ST－1菌株单一菌落放入高氏I号液体培养基中振荡培养6－8天，用细菌过滤器过滤得到ST－1菌株发酵液，4℃冰箱保存备用。

采用滤纸片法测定ST－1菌株发酵液对致病疫霉抑制作用。用灭菌后的打孔器在活化的致病疫霉上打孔并接种于黑麦培养基平板中央，在致病疫霉菌饼左右各相距15mm对称放置1片无菌滤纸片，并滴加20微升ST－1菌株发酵液，重复三次，再做三组空白试验作为对照试验，20℃生化培养箱培养观察抑菌效果，根据抑菌结果计算抑菌率。

1.3.4 处理后的ST－1菌株发酵液对致病疫霉抑制作用的测定

处理后的ST－1菌株发酵液的制备。将ST－1菌株单一菌落放入高氏I号液体培养基中，再向其液体培养基中挑入少量致病疫霉菌丝，振荡培养6－8天，用细菌过滤器过滤得到处理后的ST－1菌株发酵液，4℃冰箱保存备用。

采用滤纸片法测定。用灭菌后的打孔器在活化的致病疫霉上打孔并接种于黑麦培养基平板中央，在致病疫霉菌试验，20℃培养箱培养观察抑菌效果，根据抑菌结果计算抑菌率。

2 结果与分析

2.1 ST－1菌株对致病疫霉抑制作用的测定结果

表1:ST－1菌株对致病疫霉抑制作用结果

2.2 ST－1菌株发酵液对致病疫霉抑制作用的测定结果

将ST－1菌株发酵液与致病疫霉对峙培养8－10天，结果如图2所示，ST－1菌株的发酵液对致病疫霉没有明显的抑制作用。

图2:ST－1菌株发酵液对致病疫霉的抑制效果

2.3 处理后的ST－1菌株发酵液对致病疫霉抑制作用的测定结果

将加有少量致病疫霉菌丝的放线菌菌液过滤得到的发酵液与致病疫霉对峙培养8－10天后，结果如图3、表2所示，处理后的发酵液对致病疫霉有明显的抑制作用，抑菌率达到了30.08%。发酵液的抑菌率明显小于菌株的抑菌率。

图3:ST－1菌株被刺激后对致病疫霉的抑制效果(第10天)

表2:ST－1菌株被刺激后对致病疫霉的抑制效果(第10天)

3 结论

放线菌作为一种开发微生物药物潜力最大的微生物资源之一，已从土壤中分离纯化出许多拮抗放线菌，如放线菌NB8菌株［5］，其活体对致病疫霉抑制率为 97.33%，发酵液对致病疫霉抑制率为92.00%，而且其抑菌物质的稳定性比较强，受环境的影响比较小，传代10代后抑菌性质还基本保持稳定。可见拮抗放线菌有很大的应用潜力。

本研究着重测定放线菌ST－1对病致病疫霉的抑制作用，结果表明ST－1菌株对致病疫霉有明显的抑制作用，抑菌率达到了72.14%。而ST－1放线菌发酵液在与致病疫霉对峙培养过程中，对致病疫霉却没有明显的抑制作用，其原因可能是受到了致病疫霉本身或其代谢产物的刺激，才产生了对致病疫霉菌丝生长有抑制作用的物质，进而本研究有测定加有少量致病疫霉菌丝的ST－1菌株的发酵液，结果表明，其发酵液对致病疫霉有一定的抑制作用，抑菌率为30.08%，由此可以看出对有致病疫霉抑制作用的抑制物质的产生与致病疫霉的刺激有关系。未受到致病疫霉刺激的ST－1菌株的发酵液对致病疫霉却没有明显的抑制作用，其原因也可能是放线菌发酵液的量随着实验的进行而减少，从而抑制作用不明显。这些结果表明ST－1菌株在抑制致病疫霉菌丝生长和有效控制马铃薯、番茄的晚疫病具有较大的应用潜能，对其抑制物质的稳定性等有待进一步去开展研究。

［1］蒋继志，等.几种真菌发酵液对致病疫霉的抑制作用［J］.微生物学通报，2001，02:55－59.

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