五种松科植物提取物抑菌效果的比较分析*

武 月 红，解 玉 梅

(1.包头师范学院生物科学与技术学院，内蒙古 包头 014030;2.总装备部装备指挥技术学院士官学校门诊部，北京 102249)

近几年来，国内外许多学者调查和研究了一些植物提取物的抗菌、杀菌活性。张应烙等［1］通过井冈山47种植物丙酮提取物对几种病原菌的抑菌生物活性测定，发现山鸡椒、凹叶厚朴和深山含笑提取物中含有农用抗菌成分，且抑菌谱较广，作为植物源杀菌剂值得进一步研究。西北农林科技大学无公害农药研究服务中心对西北地区200余种植物的杀菌活性进行了初步筛选，综合分析认为，菊科和豆科植物在植物源杀菌剂的研究中值得重视［2］。喻大昭等以黄瓜灰霉病菌为供试菌，对49种植物粗提物进行了生物活性筛选，结果表明，油茶和辣蓼粗提物的抑菌活性较高，有必要进一步对其不同组分进行分离、纯化、活性追踪，最终确定其主要活性组分［3］。陈娇等通过58种植物提取液对葡萄霜霉病菌的游动孢子囊萌发抑制率和接种叶圆盘的发病控制研究，筛选出虎耳草，黄檀，马尾松，牡丹，刺槐5种具有抑菌作用的植物提取液［4］。孙海峰等以龙胆斑枯病菌为供试菌种，对9种中药乙醇提取物进行抗龙胆斑枯菌活性试验，结果发现9种中药乙醇提取物均有抑菌作用，其中蛇床子、川楝子、知母14d最低抑菌质量浓度小于0.1g/ml，具有较强的抗龙胆斑枯病菌作用［5］。此外，伞形科、卫矛科、葫芦科、桑科等植物的抗菌、杀菌活性均有过报道［6］。

为本实验选取的五种松科植物属于北方地区常见的园林绿化树种，具有来源广泛、取材方便的优势。通过其乙醇提取物对几种常见的引起植物细菌和真菌病害的致病菌的抑菌效果探究，为筛选和开发新型植物源杀菌剂提供思路;对提高松科植物的经济价值，扩大其使用范围具有重要意义。

1 实验材料与设备

1.1 供试植物

油松(Pinus tabulaeformis)、樟子松(Pinus sylvestris L.var.mongholica Litv)、白皮松(Pinus bungeana Zucc.ex Endl)、青杄(Picea wilsonii Mast)、白杄(Picea meyeri Rehd.et Wils)(以上植物均采自内蒙古包头市阿尔丁植物园)

1.2 供试菌种

三种细菌性病害大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和三种真菌病害青霉菌(Penicillium)、葡萄灰霉菌(Botrytis cinerea)和黄曲霉(Aspergillus flavus)(包头师范学院微生物实验室提供)

1.3 化学试剂

牛肉 膏、蛋 白 胨、NaCl、琼 脂 粉、NaNO3、K2HPO4、KCl、MgSO4.7H2O 、FeSO4、蔗糖、乙醇、甘油、蒸馏水、无菌水、双蒸水

1.4 主要实验设备

高压蒸汽灭菌锅、索氏提取器、旋转蒸发仪、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴锅、电子分析天平、冰箱、显微镜、微波炉、打孔器、过滤器(含无菌滤膜)、剪刀、移液枪、Peteroff－hauser记菌器、血球计数板、涂布器、接种环、镊子、试管、离心管(1.5ml)、滤纸、剪刀、封口膜、玻璃棒、三角瓶、烧杯、培养皿 、酒精灯等。

2 实验方法

2.1 菌种的活化

在超净工作台上分次以无菌操作将供试细菌从试管斜面以划线法转接到牛肉膏蛋白胨管斜面固体培养基、将供试真菌转接到察氏培养基试管斜面和培养皿平板，每种细菌各接5管左右备用，每种真菌分别接5管斜面和5个平板，操作中注意严格无菌操作，同时要试做好相应的记号避免菌种混乱。细菌转接好以后放入37℃恒温培养箱培养24－48小时使菌体达到最壮生长状态冰箱冷藏备用、真菌转接好以后放入28℃恒温培养箱，试管种待菌丝体成熟长出孢子为宜，平板种待菌丝体铺满平板即可使用，不用时冰箱冷藏。

2.2 样品提取液的制备

在植物园内分别采取新鲜完好的油松(Pinus tabulaeformis)、樟子松(Pinus sylvestris L.var.mongholica Litv)、白皮松(Pinus bungeana Zucc.ex Endl)、青杄(Picea wilsonii Mast)、白杄(Picea meyeri Rehd.et Wils)的叶片，参考晏卫红等方法［3］，无菌操作，75%酒精消毒60s，0.005%高锰酸钾溶液消毒30s，再用无菌水冲洗3次，自然烘干，得到样品材料。

2.2.1 油松提取液的制备

将准备好的油松叶片用无菌剪刀剪碎，并准确称取100g，用无菌滤纸将其裹好并放入索氏抽提管内，用95%的乙醇回流抽提2小时。如此反复共提取500g整株植物，将5次提取液收集合并，放入旋转蒸发仪，将提取液旋转蒸发蒸干，称干物质5g用5ml无菌蒸馏水完全溶解即为1g/ml的样品提取液，将原液通过无菌滤膜过滤以除去杂菌。实验时还需要用无菌蒸馏水取一定量原液配成0.9g/ml、0.8g/ml、0.7g/ml、0.6g/ml、0.5g/ml、0.4g/ml、0.3g/ml的稀释液，加原液一共8个浓度梯度，放无菌离心管标识清楚，冰箱冷藏备用。

2.2.2 其它部位植物提取液的制备

将准备好的樟子松、白皮松、青杄、白杄，同上述油松的提取液的制备方法一样，分别制备好整株植物提取1g/ml的原液，通过无菌滤膜过滤以除去杂菌，实验时用无菌蒸馏水配成 0.9g/ml、0.8g/ml、0.7g/ml、0.6g/ml、0.5g/ml、0.4g/ml、0.3g/ml的稀释液，放无菌离心管标识清楚，冰箱冷藏备用。

2.3 抑菌活性的测定

2.3.1 细菌和真菌菌悬液的制备

细菌菌悬液的制备:分别选取经过24－48小时培养后菌体生长状态最为旺盛的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1－2管，在超净工作台上无菌操作，注意做好标记。

以大肠杆菌为例:先往大肠杆菌试管斜面中倒入2ml左右无菌水，用灼烧灭菌的接种环轻轻刮动斜面的菌种，反复震荡，直接得到较浓的菌悬液，在显微镜下以Peteroff－hauser记菌器计数菌体个数，经过稀释，调至浓度为含细菌菌体106—108个/ml的大肠杆菌菌悬液，冰箱冷藏备用。

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌悬液制备方法相同。

真菌菌悬液的制备方法基本相同，计数用血球计数板在显微镜下数孢子数约为108个/ml即可。

2.3.2 滤纸片的浸泡

用打孔器取直径7mm的滤纸片，灭菌后将滤纸片分别放入五种松科植物提取物的各个稀释梯度提取液及对照无菌水中浸泡2h，待用。

2.3.3 对比相同浓度下五种松科植物提取物对三种供试细菌的抑菌活性

在超净工作台中严格按照无菌操作要求，把提前配制好的牛肉膏蛋白胨固体培养基融化后倒入直径为90mm的平皿，冷却凝固后用移液枪分别吸取三种供试细菌的菌悬液0.2ml，分散滴到平皿上，以灭菌的涂布器涂布均匀，使菌悬液渗入到培养基中。用无菌镊子分别夹取相同浓度下浸泡五种松科植物提取液并基本沥干的滤纸片(无菌水浸泡的滤纸片为空白对照)等距放在同一个平皿内，对比相同浓度下五种松科植物提取物对三种供试细菌的抑菌活性。共做八个浓度梯度，每个梯度做三组重复。置恒温培养箱中37℃下培养24h后，测量抑菌圈直径大小，取其平均值作为实验结果。并将实验结果记录。

2.3.4 对比相同浓度下五种松科植物提取物对三种供试真菌的抑菌活性

方法基本同上，只是用无菌镊子分别夹取相同浓度下浸泡五种松科植物提取液并基本沥干的滤纸片(无菌水浸泡的滤纸片为空白对照)等距放入已经培养好并且活化成功的真菌平板上(菌丝体密布平板)，对比相同浓度下五种松科植物提取物对三种供试真菌的抑菌活性。共做八个浓度梯度，每个梯度做三组重复。置恒温培养箱中28℃下培养48h后，测量抑菌圈直径大小，取其平均值作为实验结果。并将实验结果记录。

图1:五种松科植物乙醇提取物对大肠杆菌菌的抑菌效果比较

图2:五种松科植物乙醇提取物对金黄色葡萄球菌菌的抑菌效果比较

2.4 最小抑制浓度(MIC)的测定

用液体悬浮培养法测定五种松科植物提取物的对三种供试细菌的最小抑菌浓度(MIC)，具体操作过程如下:

取灭菌试管8管，用记号笔标注好，分别用移液枪加入过滤除菌的五种松科植物提取物(浓度为1g/ml)6.5ml、6.0ml、5.5ml、5.0ml、4.5ml、4.0ml、3.5ml、3.0ml，然后分别加入灭菌并冷却至 40℃以下的液体牛肉膏蛋白胨培养基定容至10ml。分别接入不同供试细菌悬液0.2ml，混匀。以无菌蒸馏水做空白对照，37℃下震荡培养，每隔2小时观察一次，视培养液变浑浊为长出细菌，而培养液澄清为无细菌长出。以供试菌能抑制生长的最低添加量为该提取物的最低抑菌浓度(MIC)，分别将结果记录于表1中。

3 结果与分析

3.1 相同浓度下五种松科植物乙醇提取物对三种供试细菌的抑菌活性比较

图3:五种松科植物乙醇提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果比较

图4:五种松科植物乙醇提取物对青霉菌的抑菌效果比较

图5:五种松科植物乙醇提取物对葡萄灰霉菌的抑菌效果比较

图6:五种松科植物乙醇提取物对黄曲霉的抑菌效果比较

通过以上6幅图可以看出，五种松科植物乙醇提取物对三种被测试细菌和三种被测试真菌在一定浓度下都表现出了抑菌作用，且在相同浓度下对细菌的抑菌作用强于真菌。就三种供试细菌而言，在相同浓度下，不同种植物提取物对供试细菌的抑菌作用表现为:油松提取物＞樟子松提取物＞白皮松提取物＞青杄提取物＞白杄提取物;对供试真菌的抑菌作用表现最强的也分别是油松、樟子松、白皮松。

3.3 最小抑菌浓度的测定结果

表1:五种松科植物提取物对三种供试细菌最小抑菌浓度比较

通过表1可以看出，五种松科植物乙醇提取物对供试细菌的最小抑菌浓度差异较为明显，油松的抑菌效果最好，对三种供试细菌的最小抑菌浓度均为0.5g/ml，即当提取液浓度大于 0.5g/ml时，表现较强的抑菌作用。樟子松的提取物对三种供试细菌的最小抑菌浓度为 0.55g/ml－0.60g/ml，抑菌效果居中;其他三种松科植物的最小抑菌浓度均高于0.60g/ml以上才能表现抑菌作用，对三种供试细菌的抑菌作用都需要在较高浓度时才有所体现。

4 结论与讨论

通过五种松科植物乙醇提取物对三种供试细菌和三种供试真菌进行抑菌实验结果表明:北方地区常见的松科植物中，油松和樟子松叶片提取物具有较强的抑菌作用，对三种供试细菌在较低浓度时就表现出一定的抑菌作用，而其它三种松科植物对三种供试细菌虽然表现出一定的抑菌作用，但是抑菌作用需要在浓度较高时体现。

实验仅采用了乙醇做提取溶剂，因而不一定能将极性和非极性较强的生物活性物质全部提取出来。由于时间和条件限制并未做多种极性不同溶剂之间的平行提取，今后如进一步研究应尽量采用各种极性不同的溶剂做平行提取。

植物的活性成分与植物的生长情况和分布情况有很大的关系，这会导致植物提取物的质量也会有差别。本实验是用植物粗提物进行测试，但有些植物样品中活性成分甚微，因而在供试浓度下未表现较强的活性。另外，对于杀菌剂而言，有的在离体条件下没有活性，但在活体植物上则表现出极强的抑菌活性，实验仅初步进行了离体实验。这些在今后的研究中应引起注意。

如何对北方地区广泛种植的其它松科或者其它常绿植物进行药用提取物方面的进一步开发利用是我们要进一步开展的课题。

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