碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆多肽的工艺条件优化

李丽娟，孟 鹏

(1.乌兰察布医学高等专科学校，内蒙古 乌兰察布 012000；2.邹城市食品药品监督管理局，山东 邹城 273500)

碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆多肽的工艺条件优化

李丽娟1，孟 鹏2

(1.乌兰察布医学高等专科学校，内蒙古 乌兰察布 012000；2.邹城市食品药品监督管理局，山东 邹城 273500)

以大豆分离蛋白为原料，地衣芽胞杆菌产碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白，分别从酶浓度、pH值、反应温度和水解时间等因素来研究水解效果，在50 ℃，pH 10,酶浓度100 U/mL，水解2 h时水解效果最好，水解度达到31.45%。

大豆分离蛋白；碱性蛋白酶；水解度；大豆多肽

大豆分离蛋白营养价值高，含有丰富的优质蛋白质，但因溶解性、胀气因子及不良气味等因素，影响了其作为食物的可接受性，而其水解产物大豆多肽，可作为一种营养食品添加剂，以其柔和丰满的口味广泛被应用[1-2]。大豆多肽的制备包括酶法和化学法，酶法制备由于优势明显，逐渐代替化学法成为主流[3]。碱性蛋白酶是一类在碱性条件下水解蛋白质的酶类，广泛存在于动植物及微生物中。碱性蛋白酶因具有较强的水解能力、耐碱能力和耐热能力，成为蛋白酶研究的热点[4]。其中在水解大豆蛋白中应用最为广泛，水解之后产生具有丰富营养价值和保健功能的大豆多肽。大豆多肽是由大豆蛋白质水解后的多种多肽分子混合物所组成，大豆多肽以分子量低于1 000 u为主，主要分布在300～700 u[5]。小分子大豆多肽不仅具有很好的溶解性、低黏度、抗凝胶形成性，而且在体内消化吸收快，蛋白质利用率高，具有较高的营养价值；大豆多肽具有低抗原性，不会产生过敏反应；能促进发酵产生有益分泌物；能增强运动员体能和肌肉，促进肌红细胞复原、帮助恢复疲劳等[6-7]。为此，以大豆分离蛋白为原料，本文主要研究了碱性蛋白酶水解大豆蛋白，通过研究酶解过程中的影响因素确定最佳酶解工艺，为大豆多肽酶法的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验材料与试剂 大豆分离蛋白：安阳漫天雪蛋白有限公司；碱性蛋白酶：地衣芽胞杆菌10006产酶；试验中所用试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器与设备 BS124S 电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；PHS-25型酸度计，上海雷磁仪器厂；DK-600B电热恒温水槽，宁波天恒仪器厂。

1.2方法

1.2.1 大豆分离蛋白预处理 配制8%的大豆分离蛋白溶液，在90 ℃下加热处理15 min左右，可使大豆蛋白致密的立体结构变得松散，有利于提高大豆蛋白的水解度。

1.2.2 酶浓度对大豆蛋白水解反应的影响 取一定量预处理好的8%大豆分离蛋白溶液，加入酶量分别达到50、100、150、200、250、300 U/mL的浓度，在反应温度60 ℃，反应pH 10.0条件下水解2 h。反应结束，测定水解液的水解度及蛋白质含量。

1.2.3 pH值对大豆蛋白水解反应的影响 取一定量预处理好的8%大豆分离蛋白溶液，分别调pH 7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，各加入蛋白水解酶，60 ℃下，搅拌反应2 h，在反应的过程中，保持各反应pH值恒定。反应结束，测定水解液的水解度及蛋白质含量。

1.2.4 反应温度对大豆蛋白水解反应的影响 将预处理好8%的大豆分离蛋白溶液分别置于30、40、50、60、70、80 ℃水浴中，调pH值为10.0，各加入酶制剂，反应2 h。反应结束，测定水解液的水解度及蛋白质含量。

1.2.5 水解时间对大豆蛋白水解反应的影响 取一定量预处理好的8%大豆分离蛋白溶液，在酶浓度200 U/mL，反应温度60 ℃,pH 10.0条件下进行水解反应，在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h后取样。测定样品的水解度和蛋白质含量。

1.2.6 正交实验 影响碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白反应的几个主要因素为底物浓度、酶浓度、反应温度、反应pH值及反应时间等，根据以上单因素结果分析，考虑到对生产效率的影响，在底物浓度采用8%、反应时间2 h时,选择反应温度、pH值、酶浓度为3个影响因素分别取3个水平，同时以水解反应的蛋白质水解度为指标进行正交实验。

1.2.7 大豆分离蛋白水解液水解度的测定采用茚三酮显色法[8]①茚三酮显色剂：茚三酮0.5 g，果糖 0.3 g，磷酸氢二钠10 g，磷酸二氢钾6 g，定容至100 mL；②标准曲线的制作：取干燥过的甘氨酸0.1 g，溶解后定容至100 mL，取2.00 mL定容至100 mL得20 μg/L的溶液。分别稀释成含量为2～20 μg/L系列溶液，同时作空白样。取2.00 mL测定稀释液于试管，加入1 mL茚三酮，混匀后置于沸水浴中加热15 min后用冷水冷却20 min加入5.00 mL的40%乙醇混匀，放置15 min后用1 cm比色杯于570 nm测吸光值A，并绘制A-C关系曲线；③样品测定：取0.5 mL水解蛋白溶液定容至50 mL，取0.4 mL稀释液移入试管中并加入1.6 mL蒸馏水混匀，加入1 mL茚三酮显色剂，混匀后置于沸水浴中加热15 min后用冷水冷却(同时作空白)，加入5.00 mL的40%乙醇溶液混合，放置5 min后用1 cm比色杯以空白管于570 nm调零测吸光值A，以此算出氨基氮的含量(mmol/L)。0.1 mL适当稀释的水解液与5 mL考马斯亮蓝G-250的溶液混合后，缓慢摇匀。在5～60 min内完成595 nm下测定吸光度。以0.1 mL的蒸馏水代替水解液作空白对照。

水解度=氨基氮的含量(μmol/L)÷ 6.25×N(mg/mL)- 0.33 (mmol/g)÷7.8 mmol/g

6.25—大豆分离蛋白的蛋白常数

0.33—每克大豆分离蛋白所含游离氨基的毫摩尔数(mmol/g)

7.8—每克大豆分离蛋白所含肽键的毫摩尔数(mmol/g)

1.2.8 考马斯亮蓝法测定蛋白含量[9]采用改良的Bradford法测定。①考马斯亮蓝G-250原液：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 95%的乙醇，加入100 mL 85%(W/V)磷酸；②标准曲线制作：0.01%考马斯亮蓝G-250测定工作液：将考马斯亮蓝G-250原液与双蒸水按15∶ 85比例混匀，过滤；牛血清白蛋白(BSA) 标准液：将1 mg BSA标准品溶于1 mL水。0.1 mol/L盐酸(新鲜配制)和双蒸水。将9支干燥洁净的试管按0～8进行编号，按表1加入试剂并摇匀。室温放置0.5 min后各管加入3.5 mL考马斯亮蓝G-250测定工作液， 摇匀，室温放置10 min后，以0号管为空白调零测定其余各管595 nm处相对吸光度；③样品的测定：0.1 mL适当稀释的水解液与5 mL考马斯亮蓝G-250溶液混合，缓慢摇匀。在595 nm下测定吸光度。以0.1 mL的蒸馏水代替水解液作空白对照。

蛋白含量=(所测的吸光度-0.041 2)÷0.458 6×N

其中，考马斯亮蓝G-250的标方 Y=0.458 6X+0.041 2，N为稀释倍数。

表1 标准曲线表

2 结果与分析

2.1酶浓度对大豆蛋白水解反应的影响

在底物大豆蛋白浓度一定时，底物的转化率取决于酶浓度。酶浓度越大，酶与蛋白质分子肽链接触几率就增加，底物转化也相应地增加，所以高剂量的酶可提高转化率，但酶成本较高，大量添加会增加成本。综合考虑水解反应速率、蛋白质水解度及生产成本之间的相互作用，确定一个最佳酶用量，可以达到低成本高效率，同时又能达到目标水解度的要求。

图1 酶浓度对大豆蛋白水解反应的影响Fig.1 Effect of enzyme concentration of hydrolytic reaction on hydrolytic degree

由图1可以看出，在反应相同的时间内，加入的酶剂量越多，水解度越高，酶浓度在250 U/mL下，水解度达到28.25%。结果也表明，水解度和蛋白含量呈负相关，大豆蛋白水解度越高，蛋白含量越低。

2.2pH值对大豆蛋白水解反应的影响

酶作为一种特殊的蛋白质分子，其催化反应的能力与环境中pH值密切相关。随着环境pH值的变化，酶分子的构象和酶分子及底物分子的解离状态也表现不同，从而影响酶与底物的结合和催化，促进或抑制酶的活性和酶促反应速度。因此，pH过高或过低对酶促反应均产生不利影响。在蛋白酶对大豆蛋白水解的过程中,由于肽键的打开会导致水解液pH值下降，因此，一般的水解过程都要外加碱以维持水解液的pH值，以确保酶的最佳活性，从而提高蛋白质的水解度并尽可能降低多肽的分子量。本试验以大豆分离蛋白为底物，研究了不同pH值条件下的酶促反应对水解度的影响。

图2 pH值对大豆蛋白水解反应的影响Fig.2 Effect of pH of hydrolytic reaction on hydrolytic degree

由图2可以看出，碱性蛋白酶在pH值为7～12的范围内，水解液的水解度随着pH的升高而增大，当pH达到11时，水解度达到最大值，当pH>11时，水解度随着pH的升高反而降低，而蛋白含量随着pH的升高而升高。所以，在本试验反应体系下，pH 11对碱性蛋白酶水解最为有利。

2.3反应温度对大豆蛋白水解反应的影响

温度对酶促反应的影响有2个方面，一方面温度提高可使反应速度加快，另一方面随着温度的提高，酶失活速度也开始加快。与普通化学反应一致，在酶的最适温度以下，随着温度的升高，反应物的能量增加，单位时间内分子间的有效接触次数增加，反应速度越快。如果反应体系中温度超过酶的最适温度，酶分子吸收了过多的能量，引起维持酶分子结构的次级键解体，导致变性，因而使酶活性减弱甚至丧失催化能力。这2方面的综合影响导致酶促水解反应存在着最适温度，偏离最适值会降低水解效果。

图3 反应温度对大豆蛋白水解反应的影响Fig.3 Effect of temperature of hydrolytic reaction on hydrolytic degree

图3结果表明，50 ℃时水解液水解度最高，蛋白含量最低，当反应温度小于50 ℃时，水解度与温度之间呈现正相关性；当反应温度大于50 ℃时，水解度与温度之间呈现负相关性。所以，本试验条件下，通过单因素分析碱性蛋白酶水解的最适温度为50 ℃。

2.4水解时间对大豆蛋白水解反应的影响

图4 水解时间对大豆蛋白水解反应的影响Fig.4 Effect of time of hydrolytic reaction on hydrolytic degree

由图4结果可见，水解率随反应时间的延长而增大。但2 h后增加的辐度比较缓慢，只有2 h前的水解时间内变化辐度较快一些,由1.25%增大到22.71%，2 h后则不明显。

2.5正交实验

一般来讲，要达到同样的水解率，水解时间同酶用量有关，酶用量大，水解时间可短些。同样加酶用量，时间愈长，水解度愈高，但到一定时间后上升趋势减缓。选择反应温度、pH值、酶浓度为3个影响因素分别取3个水平，同时以水解反应的蛋白质水解度为指标进行正交实验，反应编号与相应反应条件如表2所示。

表2 正交实验设计方案

图5 正交反应实验结果Fig.5 Result of orthogonal experiment

由图5可知，在50 ℃，pH 10，酶浓度100 U/mL时水解效果最高，水解度达到了31.45%，此时蛋白含量也处于最低值。按此方案使得水解度有了较大提高，对试验和生产有重要的指导意义。

3 小 结

碱性蛋白酶在pH 7～12的范围内，水解液的水解度随着pH的升高而增大，当达到pH 11时，水解度达到最大值；而当pH>11时，水解度随着pH的升高反而降低。而水解度和蛋白含量呈负相关，大豆蛋白水解度越高，蛋白含量越低。50 ℃时水解液水解度最高，当反应温度小于50 ℃时，水解度与温度之间呈现正相关性;当反应温度大于50 ℃时，水解度与温度之间呈现负相关性。水解率随反应时间的延长而增大，但后期增大的程度比较缓慢，只有2 h前的水解时间内水解度增长较快一些，2 h后不明显。正交实验中，选择反应温度、pH值、酶浓度为3个影响因素分别取3个水平，同时以水解反应的蛋白质水解度为指标进行正交试验，在50 ℃，pH 10,酶浓度100 U/mL，水解2 h时水解效果最高，水解度达到31.45%。

[1] 钱芳,邓岩,王凤翼,等.碱性内切蛋白酶水解大豆蛋白的研究[J].大连轻工业学院学报,2000,19(1):40-43.

[2] 林敏刚.碱性蛋白酶在水解植物蛋白中的应用[J].中国油脂,2009,34(12):30-32.

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[9] 汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京:科学出版社,2002:38-50.

·写作常识·

引言

引言(也称前言、序言或概述)经常作为科技论文的开端，提出文中要研究的问题，引导读者阅读和理解全文。

1 引言的内容

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引言也可点明本文的理论依据、实验基础和研究方法，简单阐述其研究内容；三言两言预示本研究的结果、意义和前景，但不必展开讨论。

2 引言的写作要求

2.1 开门见山，不绕圈子。避免大篇幅地讲述历史渊源和立题研究过程。

2.2 言简意赅，突出重点。不应过多叙述同行熟知的及教科书中的常识性内容，确有必要提及他人的研究成果和基本原理时，只需以参考引文的形式标出即可。在引言中提示本文的工作和观点时，意思应明确，语言应简练。

2.3 尊重科学，实事求是。在论述本文的研究意义时，应注意分寸，切忌使用“有很高的学术价值”、“填补了国内外空白”、“首次发现”等不适之词；同时也要注意不用客套话，如“才疏学浅”、“水平有限”、“恳求指教”、“抛砖引玉”之类的语言。

2.4 引言的内容不应与摘要雷同，也不应是摘要的注释。引言一般应与结论相呼应，在引言中提出的问题，在结论中应有解答，但也应避免引言与结论雷同。

2.5 引言不必交待开题过程和成果鉴定程序，也不必引用有关合同公文和鉴定的全部结论。

2.6 简短的引言，最好不要分段论述，不要插图列表和数学公式的推导证明。

TechnologyOptimizationtoPrepareSoybeanPolypeptidethroughHydrolyzingSoybeanSeparatedProteinwithAlkalineProteasefromBacilluslicheniformis

LI Li-juan1, MENG Peng2

(1.WulanchabuHigherProf.Med.Coll.,WulanchabuCity012000,InnerMongolia; 2.ZouchengCityFood&DrugAdminist’n,ZouchengCity273500,Shandong)

Alkaline protease fromBacilluslicheniformiswas used to hydrolyze separated soybean protein as raw material, and the hydrolyses effects were studied respectively with enzyme concentration, pH, reaction temperature, hydrolysis time, and other factors; under pH 10, 50 ℃, reacted with 100 U/mL enzyme concentration, hydrolyzing for 2 h the effect was the best with the degree of hydrolysis at 31.45%.

separated soybean protein; alkaline protease; soybean polypeptide; hydrolysis degree

李丽娟 女，讲师。研究方向为酶工程。E-mail：lilij2002@126.com

2013-10-25；

2013-11-06

Q93

A

1005-7021(2014)04-0062-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2014.04.012