红平菇产漆酶条件优化及对孔雀绿染料脱色的研究

郑苗苗，焦战战，张令昂，邵淑丽，翟 莹

(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

漆酶(laccase)是一种含铜的多酚氧化酶，属于氧化酶的蓝铜家族。含有4个铜原子，分别位于3个不同结合位点，并且高度保守［1］。1883年由日本吉田在漆树中发现漆酶，1893年Laborde在真菌中发现了漆酶。现在已证实漆酶普遍存在于细菌、真菌、植物、昆虫中［2］，其中真菌中白腐菌是最重要的漆酶生产菌［3］。漆酶能够催化许多芳香族化合物并有广泛的作用底物，具有很大的实际应用价值。近年来，漆酶在造纸工业［4］、食品工业［5］等领域得到了深入的研究和广泛应用，尤其是在环境保护方面更是研究的热点，如环境中有毒有害物质的降解［6］、染料脱色［7］及土壤中杂酚油类物质的去除［8］等，对于环境污染物的消除起着很大作用。本文选用白腐真菌红平菇Pleurotus djamor为材料，对该菌株产漆酶的培养基进行优化，从而获得最佳产漆酶条件，优化后的粗酶液应用于合成染料的脱色，进而对环境污染防治具有理论指导意义和广泛的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 红平菇Pleurotus djamor购自福建三明真菌研究所，由齐齐哈尔大学微生物实验室保存。

1.1.2 主要试剂 DMP(2，6-Dimethoxyphenol)、ABTS(2，2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic))购自Sigma公司，其余有机及无机试剂为国产分析纯试剂。供试染料由齐齐哈尔大学微生物实验室提供。

1.1.3 培养基 固体培养基(g/L):葡萄糖20，马玲薯200，琼脂 20，KH2PO43.0，MgSO41.5，pH值自然;产酶初始培养基:低氮天冬酰胺-琥珀酸培养基(Low Nitrogen Asparagine Succinicacid，LNAS)［9-10］，是一种营养成分有限的初始产酶培养基。以上培养基均在1×105Pa灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 产酶培养方式 在锥形瓶中加入70 mL LNAS基础培养基，然后各加入4种不同底物进行菌丝培养:A、LNAS培养基不含Cu2+，即矿物元素溶液中不添加CuSO4·H2O;B、LNAS培养基含Cu2+(2.5 ×10－3mmol/L)，即矿物元素溶液中添加 CuSO4·H2O;C、LNAS 培养基含 Cu2+(2.5 ×10－3mmol/L)，并加入 10 mmol/L 2，6-二甲氧基苯酚(2，6-DMP)0.1 mL 为产酶底物;D、LNAS 培养基含 Cu2+(2.5 ×10－3mmol/L)，并加入 2 g青杨木屑为产酶底物。接菌前向每个锥形瓶中加入5 mL的15%葡萄糖溶液。将保藏在PDA培养基上的红平菇菌种，用打孔器在菌丝边缘进行打孔，将菌饼转接至锥形瓶中，26℃静止培养，每项试验设3个重复。培养3 d后，每隔1 d提取胞外酶液，一直测到第21天，将提取的粗酶液离心后取上清进行酶活测定。

1.2.2 漆酶活力的测定 分光光度计检测漆酶在420、470、310 nm下与底物在25℃反应1 min的吸光度，计算漆酶活性。酶活单位(U/L):1 min催化1 μmol ABTS所消耗的酶量。计算中的ε420=36000 mol·L－1·m－1、ε470=49600 mol·L－1·cm－1、ε310=9300000 mol·L－1·cm－1。计算酶活值后绘制出产酶活时间曲线图，测定吸光度体系为:空白对照管中加2.95 mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 3.4)和50 μL稀释后的酶液;检测管中加1.95 mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 3.4)，50 μL 稀释后的酶液，1 mL 1 mmol/L ABTS。所有测量均重复3次取平均值。

1.2.3 染料及脱色率 染料:SN4R:杭州方顺化工有限公司;甲基橙:沈阳市新光化工厂公司;孔雀绿:上海抚生实业有限公司;中性红:天津市大茂化学试剂厂。利用紫外可见分光光度计在300～800 nm区间扫描，得到在此区间4种染料的最大吸收峰值:孔雀绿558 nm，Abs=3.511;中性红527 nm，Abs=3.514;甲基橙486 nm，Abs=1.876;SN4R 432 nm，Abs=0.659。重组酶液、4 种染料(40 mg/L)和50 mmol/L的柠檬酸-磷酸盐缓冲液总体积为3 mL，间隔一定时间检测4种染料的吸光度值，得到吸光度为A1;对照中加入等量的含空质粒酶液，测得其吸光度为A0。染料脱色率计算:

2 结果与分析

2.1 红平菇在不同培养液中漆酶酶活性变化

在21 d的培养过程中，不同培养液中漆酶酶活性大小不同，结果见图1。A、不含Cu2+培养液:在不含Cu2+的LNAS培养基不加底物条件下，提取的酶液可以检测到的漆酶的活性，活性很低，在第9天达到最大酶活力仅为66.5 U/L。B、含Cu2+培养液:在含Cu2+的LNAS培养基中不加底物条件下，提取的酶液可以检测到漆酶的活性，也在第9天时达最大分泌量，酶活力达235.4 U/L。C、含 Cu2+加入 2，6-DMP培养液:在含 Cu2+的LNAS培养基中加入2，6-DMP为底物的条件下，提取的酶液也检测到漆酶的活性变化，在第9天达到最大分泌量，酶活力为253.4 U/L。D、含Cu2+加入木屑培养液:在含Cu2+的LNAS培养基中加入木屑为底物条件下，提取的酶液检测到漆酶的活性变化，漆酶在第9天达到最大分泌量，酶活力为458.8 U/L。以木屑为底物漆酶的分泌量要高于以2，6-DMP为底物的漆酶产生量，其吸收峰在420 nm处有明显的峰值变化。

图1 红平菇在不同培养液中漆酶酶活变化Fig.1 Pleurotus djamor laccase enzyme activity changes in different cultures

2.2 漆酶对染料脱色结果

于含有CuSO4培养液中加入木屑，培养到第9天，将发酵液于8000 r/min离心6 min，取上清液，分别对SN4R、甲基橙、孔雀绿和中性红4种染料的脱色能力进行测定，见图2。

图2 粗酶液对4种染料脱色率比较Fig.2 Crude enzyme solution of four kinds of dye r D/%

结果表明，红平菇漆酶对4种染料具有脱色能力，并且脱色效果均不相同。对偶氮类孔雀绿在6 h时脱色率为87.5%，蒽醌类SN4R在24 h时脱色率为49.4%，偶氮类甲基橙在24 h时脱色率为45%，杂环类中性红在24 h时脱色率为23.6%。因此，显示出红平菇漆酶对孔雀绿染料脱色具有较大的应用潜力，进而对废水处理具有更好的应用前景。

3 讨论

在4种不同培养基中，红平菇漆酶在第3天开始分泌，随后迅速升高，在第9～11天分泌量达到最高，之后迅速下降，到第15天趋向消失。通过A、B两种培养液的检测表明，漆酶的分泌量受Cu2+影响较大，Cu2+是红平菇产漆酶的必要因子，在含Cu2+的LNAS培养基中漆酶的活性明显提高。肖楚等［11］也证明Cu2+对漆酶活性有明显的促进作用，但漆酶活性大小低于本试验菌种，可以应用到漆酶工业化生产领域。通过C、D两种培养液的检测表明，在培养过程中添加2，6-DMP和木屑为底物均可提高漆酶的分泌量，证明不同底物对红平菇产漆酶起到诱导作用。Pseudotrametes gibbosa和Grifola frondosa在培养过程中添加2，6-DMP和木屑为底物，漆酶活性提高［12-13］，但与本实验相比漆酶活性较低，可能与Cu2+诱导有关，而其他3种培养方式的漆酶吸光度和吸收峰表现为不明显的变化。

红平菇漆酶对SN4R、甲基橙、孔雀绿和中性红4种染料都具有脱色能力，在5 U/mL的酶活力下，6 h时对孔雀绿脱色效果就达到87.5%。Myrothecium verrucaria来源的漆酶对孔雀绿脱色效果为66.9%［14］。Chaetomium sp.R01 来源的漆酶对孔雀绿脱色效果为26%［15］。显示了红平菇漆酶对孔雀绿脱色效果要好于已发表的其他白腐真菌来源的漆酶，期望在工业生产中发挥重要作用［16］。

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