三羟异黄酮对HER2/neu高表达人乳腺癌细胞辐射敏感性的影响

李 明，周 永，谭宗才，徐 敏，郑钧丰，常 蕾，张 林，屈 琳，糜漫天

三羟异黄酮对HER2/neu高表达人乳腺癌细胞辐射敏感性的影响

李 明，周 永，谭宗才，徐 敏，郑钧丰，常 蕾，张 林，屈 琳，糜漫天

目的 探讨三羟异黄酮对人乳腺癌细胞株MDA-MB-453(ER-,HER2-high)、MCF-7/HER2(ER+,HER2-high)和MCF-7(ER+,HER2-low)辐射敏感性的影响，并观察三羟异黄酮对HER2/neu高表达人乳腺癌细胞辐射敏感性的作用。方法 通过基因转染技术建立HER2/neu高表达的人乳腺癌MCF-7细胞，免疫荧光细胞化学法鉴定；经100 mol/L三羟异黄酮联合或单独10 Gy γ射线处理MDA-MB-453、MCF-7/HER2和MCF-7三种乳腺癌细胞24 h后，采用流式细胞仪检测三羟异黄酮对乳腺癌细胞辐射敏感性的影响。结果 与对照组相比，MDA-MB-453、MCF-7/HER2细胞的射线组凋亡率无显著差异(P>0.05)，三羟异黄酮联合射线组的凋亡率，与射线组和对照组相比，分别增加25.51%(P<0.05)、56.16%(P<0.05)；MCF-7细胞射线组凋亡率比对照组增加4.62%(P<0.05)，而三羟异黄酮联合射线组与射线组比较没有显著差异(P>0.05)。结论 HER2/neu高表达的乳腺癌细胞对射线诱导的凋亡有抵抗作用，但三羟异黄酮可增强γ射线诱导HER2/neu高表达乳腺癌细胞MDA-MB-453细胞、MCF-7/HER2细胞的凋亡作用。

三羟异黄酮；人乳腺癌细胞；辐射敏感性；MCF-7/HER2;MDA-MB-453

乳腺癌是女性的常见恶性肿瘤。近20年来，我国乳腺癌的发病率明显上升，成为危害女性健康的主要疾病之一。放射治疗是乳腺癌治疗中的一项重要手段，提高放疗效果在临床上非常必要[1]。在乳腺癌患者中，25%～30%的患者HER2/neu受体高表达。HER2/neu由原癌基因erbB-2/neu表达，为表皮生长因子受体家族成员，具有络氨酸激酶(PTK)活性。研究发现HER2/neu高表达乳腺癌恶性程度高，肿瘤生长速度快，易转移，对射线和化疗药物不敏感，治疗预后差且易复发[2]。临床研究发现[3]，HER2/neu过度表达的乳腺癌对放疗的敏感性低于HER2/neu低表达的乳腺癌，血清中HER2/neu胞外区蛋白水平升高与乳腺癌对放疗的疗效降低密切相关，提示HER2/neu表达水平与乳腺癌细胞辐射抵抗有密切关系。三羟异黄酮是一种重要的天然植物雌激素，对人体无明显毒副作用，其结构与雌二醇非常相似，具有模拟和拮抗雌激素、抑制PTK活性等重要药理作用[4-7]。本实验选择两种人乳腺癌细胞株MDA-MB-453(ER-,HER2-high)和MCF-7(ER+,HER2-low)，并通过基因转染技术建立HER2/neu高表达的乳腺癌MCF-7细胞(MCF-7/HER2,ER+,HER2-high)，检测三羟异黄酮对不同乳腺癌细胞株体外辐射敏感性的影响，观察三羟异黄酮对HER2/neu高表达人乳腺癌细胞辐射敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM/F12为HyClone公司产品；RPMI1640、胰蛋白酶为Gibco产品；新生胎牛血清购自天津TBD公司；Genistein、MTT、曲拉通(Triton-X 100)为Sigma产品；质粒抽提试剂盒购自Promega公司；各种限制性内切酶、T4DNA 连接酶、购自TaKaRa公司；Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；鼠抗人HER2/neu单克隆抗体购自Zytmed公司；山羊抗小鼠IgG购自北京中杉公司。

1.2 质粒 含人HER2/neu基因的质粒pCMV/ERBB2由美国Anderson癌症研究中心的Ming Tan教授惠赠；含新霉素抗性基因的质粒pCIneo由第三军医大学熊政硕士惠赠。

1.3 细胞株及感受态细菌 MCF-7细胞、MDA-MB-453均购自中科院上海细胞库。pCMV/ERBB2质粒扩增、酶切鉴定并测试浓度后与pCIneo质粒共转染MCF-7乳腺癌细胞，400 μg/ml G418筛选MCF-7细胞，建立稳定高表达HER2/neu的乳腺癌细胞(MCF-7/HER2)。DH5α感受态细菌由第三军医大学医学检验系临床生化教研室张竹君硕士惠赠。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 MCF-7和MCF-7/HER2细胞株均用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2、100%饱和湿度条件下常规传代培养，MCF-7/HER2培养基中加入100 μg/ml G418筛选细胞；MDA-MB-453细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37 ℃、5% CO2、100%饱和湿度条件下常规传代培养。

1.4.2 质粒转化与扩增 按文献[8]的方法，将pCIneo质粒和含人HER2/neu基因的pCMV/ERBB2质粒分别转化感受态细菌DH5α。按照Promega质粒抽提试剂盒说明书，分别对上述二质粒进行提取、纯化，并测定浓度，-20 ℃保存备用。

1.4.3 质粒转染 含人HER2/neu 基因的质粒pCMV/ERBB2 经扩增、酶切鉴定和浓度测定后，与pCIneo质粒共转染MCF-7 乳腺癌细胞，按照脂质体转染试剂盒说明书进行，然后在倒置荧光显微镜下初步观察转染是否成功。而后以400 μg/ml G418 初筛MCF-7细胞，对照组细胞完全死亡后，以100 μg/ml G418 维持筛选，传代并冻存备用，免疫荧光细胞化学法检测转染是否成功。

2 结果

2.1 pCMV/ERBB2质粒酶切鉴定 pCMV/ERBB2质粒以ColE1为母本质粒，在其中插入CMV强启动子和人erbB-2/neu cDNA基因构建而成。根据pCMV/ERBB2质粒图谱(图1)，该质粒全长9130 bp，含有多个限制性内切酶位点，其中包括2个Hind Ⅲ和1个XhoⅠ内切酶的酶切位点，用限制性内切酶XhoⅠ和Hind Ⅲ酶切pCMV/ERBB2质粒后，电泳所得3个DNA片段为4479 bp(含erbB-2/neu片段)、3593 bp(含CMV启动子)和1026 bp，符合理论计算值(图1)。

图2 免疫荧光细胞化学法鉴定HER2转染前后的MCF-7细胞(×600)

A：对照；B：pCIneo质粒转染MCF-7细胞(白色箭头所示为pCIneo蛋白)；C：pCIneo和PCMV/ERBB2质粒共转染MCF-7细胞(白色箭头所示为pCIneo蛋白，灰色箭头所示为HER2蛋白)

图1 pCMV/ERBB2和pCIneo质粒鉴定

M：Marker；1和3：pCMV/ERBB2质粒酶切片段；2和4：pCMV/ERBB2质粒；5：pCIneo质粒

2.2 免疫荧光细胞化学法鉴定pCIneo和PCMV/ERBB2共转染的MCF-7细胞 PCMV/ERBB2质粒扩增、酶切鉴定并测试浓度后，与含新霉素抗性基因的空载体pCIneo质粒(带有绿色荧光信号)共转染MCF-7乳腺癌细胞，免疫荧光细胞化学法鉴定。如图2所示，PCMV/ERBB2质粒和含新霉素抗性基因质粒共转染的MCF-7细胞，在细胞膜和细胞质分别可见红色和绿色荧光，而只转染含新霉素抗性基因质粒的MCF-7细胞于细胞膜和细胞质可见绿色荧光，而未转染任何质粒的MCF-7细胞则无任何荧光信号。结果表明，在PCMV/ERBB2转染后的MCF-7细胞，HER2/neu高表达，主要分布于细胞膜和细胞质；而在单独转染含新霉素抗性基因质粒的MCF-7细胞和未转染任何质粒的MCF-7细胞，HER2/neu不表达，提示成功地将PCMV/ERBB2质粒和pCIneo质粒共转入了MCF-7细胞。

2.3 三羟异黄酮联合γ射线对MCF-7、MCF-7/HER2、MDA-MB-453乳腺癌细胞凋亡的影响 经100 mol/L三羟异黄酮联合或单独10 Gy γ射线处理MDA-MB-453、MCF-7/HER2、MCF-7三种乳腺癌细胞24 h后，流式细胞仪分析发现MDA-MB-453、MCF-7/HER2细胞的射线组凋亡率，与对照组相比无明显差异(P>0.05)，而三羟异黄酮联合射线组的凋亡率分别增加25.51%(P<0.05)、56.16%(P<0.05)；MCF-7细胞射线组凋亡率，与对照组相比增加4.62%(P<0.05)，而三羟异黄酮联合射线组与射线组比较无明显差异(P>0.05)，提示HER2高表达的乳腺癌细胞对射线诱导的凋亡有抵抗作用，但三羟异黄酮可增强γ射线诱导HER2高表达乳腺癌细胞的凋亡作用。见表1。

表1 不同条件处理24 h后细胞凋亡率的变化(n=3,%)

注：与对照组比较，①P<0.05；与γ射线组比较，②P<0.01

3 讨论

乳腺癌的综合治疗中，放射治疗与手术治疗一样属于局部治疗，占有十分重要的地位。但多种因素会影响放疗的效果，如肿瘤组织的低氧状态、肿瘤本身的放射敏感性以及肿瘤细胞对放射线的抵抗等。放射线入射生物体后，直接损伤大分子DNA，或通过其产生的自由基的间接作用，导致DNA损伤或细胞死亡等生物效应。这种应用放射治疗肿瘤的方法，就是放射治疗(放疗)。放疗诱导肿瘤细胞凋亡是其发挥抗癌作用的重要机制之一，但由于个体之间或肿瘤细胞本身对射线的反应存在很大差异，即存在细胞内在放射敏感性(intrinsic radiosensitivity)差异，往往导致疗效不佳。因此如何提高肿瘤细胞的放射敏感性一直是肿瘤放射领域中备受关注的问题。已有为数不多的放射增敏剂应用于临床或正在进行临床试验。放射增敏剂是化学修饰的一种。所谓化学修饰是指在癌症的治疗中，主要通过其对肿瘤及正常组织的放射及/或药物的修饰效应，而不是其细胞毒作用起效的一类药物[9]。三羟异黄酮又名染料木素或金雀异黄酮，为大豆异黄酮主要成分之一，是一种重要的天然植物雌激素，具有雌二醇母核机构，对人体无明显毒副作用。体内体外实验研究发现[10-12]，三羟异黄酮可通过调节与细胞周期和凋亡相关基因来抑制多种癌细胞的生长，三羟异黄酮通过抑制NF-κB和Akt活性，导致癌细胞生长和凋亡的抑制。在乳腺癌患者中，25%～30%的患者HER2/neu受体高表达。HER2/neu受体为表皮生长因子受体家族成员，具有PTK活性。HER2/neu高表达乳腺癌恶性程度高，肿瘤生长速度快，易转移，对射线和化疗药物的不敏感，治疗预后差且易复发。有研究发现[10]，三羟异黄酮作为一种TPK抑制剂，能够通过抑制射线诱导激活的AKT细胞生长信号通路来促进食管癌细胞的辐射敏感性。本实验以MDA-MB-453、 MCF-7、MCF-7/HER2乳腺癌细胞为研究对象，经100 mol/L三羟异黄酮联合或单独10 Gy γ射线处理MDA-MB-453、MCF-7/HER2、MCF-7三种乳腺癌细胞24 h后，流式细胞仪分析发现HER2/neu高表达乳腺癌细胞MDA-MB-453、MCF-7/HER2的射线组凋亡率，与对照组相比没有显著差异(P>0.05)，而三羟异黄酮联合射线组的凋亡率分别增加25.51%(P<0.05)、56.16%(P<0.05)；HER2/neu低表达或不表达的乳腺癌细胞MCF-7射线组凋亡率，与对照组相比增加4.62%(P<0.05)，而三羟异黄酮联合射线组与射线组比较没有显著差异(P>0.05)；该结果提示HER2高表达的乳腺癌细胞对射线诱导的凋亡产生抵抗作用，而三羟异黄酮能有效地增强HER2高表达乳腺癌细胞的辐射敏感性。我们推测三羟异黄酮增强HER2/neu高表达乳腺癌细胞的辐射敏感性与其抑制HER2/neu的TPK活性有关。

[1] Menard S,Pupa SM,Campiglio M,et al.Biological and therapeutic role of HER2 in cancer[J].Oncogene,2003,22(42):6570-6578.

[2] Johnstone RW,Ruefli AA,Lowe SW.Apoptosis:a link between cancer genetics and chemotherapy[J].Cell,2002,108(2):153-164.

[3] Knuefermann C,Lu Y,Liu B,et al.HER2/PI-3K/Akt activation leads to a multidrug resistance in human breast adenocarcinoma cells[J].Oncogene,2003,22(21):3205-3212.

[4] Lopez-Lazaro M,Akiyama M.Flavonoids as anticancer agents:structure-activity relationship study [J].Curr Med Chem Anti-Canc Agents,2002,2(6):691-714.

[5] Suthar AC,Banavalikar MM,Biyani MK.Pharmacological activities of genistein,an isoflavone from soy(Glycine max):part Ⅰ-anticancer activity[J].Indian J Exp Biol,2001,39(6):511-519.

[6] Arliss RM,Biermann CA.Do soy isoflavones lower cholesterol,inhibit atherosclerosis,and play a role in cancer prevention [J]?Holist Nurs Pract,2002,16(5):40-48.

[7] Castle EP,Thrasher JB.The role of soy phytoestrogens in prostate cancer[J].Urol Clin North Am,2002,29(1):71-81.

[8] Joe Sambrook,David Russell.分子克隆实验指南[M].黄培堂译.3版.北京:科学出版社,2002:93-95.

[9] Stephens L,Anderson K,Stokoe D,et al.Protein kinase B that mediate phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-dependent activation of protein kinase B[J].Science,1998,279(5351):710-714.

[10] Wang JM,Chao JR,Chen W,et al.The antiapoptotic gene mcl-1 is upregulated by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway through a transcripition factor complex containing GREB[J].Mol Cell Biol,1999,19(9):6195-6206.

[11] Altomare DA,Lyons GE,Mitsuunchi Y,et al.Akt2 mRNA is highly expressed in embryonic brown fat and the AKT2 kinase is activated by insulin[J].Oncogene,1998,16(18):2407-2411.

Effect of Genistein on Radiosensitivity of Breast Cancer Cells with High Expression of HER2/neu

Li Ming1,Zhou Yong2,Tan Zongcai3,Xu Min1,Zheng Junfen1,Chang Lei1,Zhang Lin1,Qu Lin1,Mi Mantian2

1.Center for Disease Control and Prevention of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610021,China;2.Staff Room of Nutrition and Food Hygiene,College of Military Preventive Medicine,the Third Military Medical University,Chongqing,400037,China;3.The Second Regiment,Comprehensive Training Base of Guangzhou Military Command,Zhuzhou,Guangzhou,412005,China

Objective To investigate the effects of genistein on the radiosensitivity of human breast cancer cell strains with expression of MDA-MB-453(ER-,HER2-high),MCF-7(ER+,HER2-high),and MCF-7/HER2(ER+,HER2-low),and to observe the effects of genistein on the radiosensitivity of HER2/neu highly expressed human breast cancer cells.Methods Highly expressed HER2/neu human breast cancer cell MCF-7 was constructed through cell transfection technology and was identified by immunofluorescence cytochemical technology.After the three kinds of breast cancer cells i.e.MDA-MB-453,MCF-7/HER2,and MCF-7 were treated by 100 μmol/L genistein combined with or simply use of 10 Gy γ ray,flow cytometry was used to analyze the effects of genistein on the radiosensitivity of the breast cancer cells.Results There was no significant difference between the apoptotic rates of MCF-7/HER2 and MDA-MB-453 cells treated by γ ray compared with those of the control group(P>0.05).The apoptotic rates of those cells treated by genistein combined with γ ray increased by 25.51%(P<0.05)and 56.16%(P<0.05),respectively,compared with those of the cells treated only by γ ray and the control group.The apoptotic rate of MCF-7 cells treated by γ ray increased by 4.62%(P<0.05)compared with that of the control group(P<0.05),but there was no significant difference between the apoptotic rates of the cells in the γ ray and the control group(P>0.05).Conclusions HER2/neu highly expressed breast cancer cells have resistant effect on the apoptosis induced by γ ray,but genistein can increase the apoptotic effect of HER2/neu highly expressed human breast cancer cells induced by γ ray.

genistein;tumor;γ ray; MDA-MB-453; radiosensitivity;MCF-7 HER2

重庆市自然科学基金(CSTC 2006 BB 5103)

610021 成都，成都军区疾病预防控制中心(李 明，徐 敏，郑钧丰，常 蕾，张 林，屈 琳)；第三军医大学军事预防医学院营养与食品卫生学教研室(周 永，糜漫天)；广州军区综合训练基地二大队(谭宗才)

糜漫天，电话：023-687752292

R 737.9

A

1004-0188(2014)04-0358-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.04.004

2014-01-28)