PTEN、p-Akt在肝癌组织中的表达及其与上皮间质转化的关系

张 勇，汤小玉，李荣清，冯旭东，张燕华，王 丽

·论著·

PTEN、p-Akt在肝癌组织中的表达及其与上皮间质转化的关系

张 勇，汤小玉，李荣清，冯旭东，张燕华，王 丽

目的 探讨抑癌基因PTEN及其下游调控因子磷酸化Akt(p-Akt)在肝癌组织中的表达，并以上皮表型E-cadherin和间质表型Snail为标志，研究PTEN与上皮间质转化(EMT)在肝癌恶性进展过程中的作用。方法 采用免疫组化EnVision法，检测80例肝细胞肝癌组织中PTEN、p-Akt、E-cadherin及Snail的表达情况，分析PTEN与p-Akt、Snail及E-cadherin表达的相关性。结果 在肝癌组织中，PTEN、p-Akt、E-cadherin及Snail的表达率分别为46.25%、42.50%、67.50%及33.75%。PTEN、E-cadherin的表达率随着病变的进展而降低；而p-Akt和Snail的表达模式与PTEN、E-cadherin相反，表达率随着肝癌组织病变的进展而升高。Spearman相关分析显示，PTEN 的表达与p-Akt、Snail的表达呈负相关(r值分别为-0.696、-0.291，P<0.05)，与E-cadherin的表达呈正相关(r=0.537，P<0.05)；Snail的表达与E-cadherin的表达呈负相关(r=-0.464，P<0.05)。结论 肝癌的恶性进展可能与PTEN表达缺失导致的PI3K/AKT通路持续活化，进而促进EMT的发生有关；以PTEN为靶点提高其在肝癌组织中的表达，有望成为拮抗EMT、抑制肝癌恶性进展的新途径。

肝癌；PTEN；上皮间质转化；表达

原发性肝细胞肝癌(hepatocelluar carcinoma，HCC)居我国癌症发病率的第2位,肿瘤细胞发生上皮间质转化(epithelial mesenchymal transitions，EMT)是其复发和治疗失败的重要原因。EMT是指在某些特殊条件下，上皮细胞失去极性，转变为具有活动能力的间质细胞的过程。EMT的过程涉及多个信号转导通路[1]，在肝癌的发展过程中，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)可与癌基因C-met结合，激活PI3K-AKT信号途径，促进EMT的发生[2]。抑癌基因PTEN是PI3K-AKT途径中重要的负性调控子，在肝癌中存在广泛的缺失或表达低下。尽管有研究表明，PTEN缺失可诱导部分肿瘤细胞发生EMT[3]，但在肝癌的研究中还未见相关报道。因此，本研究通过检测PTEN及其在PI3K/AKT途径中的下游调控因子磷酸化的Akt(p-Akt)在肝癌组织中的表达，并以上皮表型E-cadherin和EMT调控因子Snail为标志，分析肝癌发展过程中PTEN与EMT的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集笔者医院病理科手术及穿刺活检标本蜡块共80例，所有标本均经临床病理确诊为肝细胞肝癌。其中，男性患者62例，女性18例，年龄27～78岁，平均51.37岁。肝癌的病理组织分级按照WHO分级标准分为：高分化(Ⅰ级)8 例，中分化(Ⅱ级)39例，低分化(Ⅲ级)28例，未分化(Ⅳ级)5例。肝癌恶性进展的临床客观指标根据CLIP评分标准[4]：0分6例，1分19例，2分27例，≥3分28例。将有血管侵犯、肝内卫星癌灶、淋巴结转移以及远处转移HCC患者列为高侵袭组，反之列为低侵袭组[5]：80例中高侵袭组39例，低侵袭组41例。全部病例术前均未接受任何化疗、放疗或其他抗肿瘤治疗。所有标本均用40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，分别做HE和免疫组化染色。兔抗人多克隆抗体PTEN、Snail、E-cadherin为Abcam公司产品，工作浓度分别为1∶100、1∶100、1∶30；兔抗人单克隆抗体p-Akt为Cell Signaling Technology公司产品，工作浓度为1∶50；EnVision染色试剂盒ChemMateTM为Dako公司产品。

1.2 方法 采用免疫组化EnVision法。染色步骤：将切片脱蜡水化，高压抗原修复2 min，加一抗4 ℃过夜，PBS漂洗3×5 min；二抗37 ℃孵育60 min，PBS 漂洗3×5 min；常规DAB显色液，显微镜下观察信号并终止显色，苏木素复染，乙醇脱水、透明、中性树胶封片。以已知阳性结果的阳性片为阳性对照，以已知阴性结果的阴性片为阴性对照，以PBS替代一抗的免疫组化染色结果为空白对照。

1.3 结果判断 PTEN的阳性部位为细胞质，p-Akt的阳性部位为胞核和胞浆，E-cadherin的阳性部位为细胞膜和少许细胞质，Snail阳性信号位于胞核和胞浆。判断阳性反应根据以下两个方面[6]：(1)按切片中显色癌细胞数比例计分：0分无癌细胞显色；1分显色癌细胞占癌细胞总数<25%；2分显色细胞超过切片中癌细胞总数的25%，但<50%；3分显色细胞超过切片中癌细胞总数的50%。(2)按切片中癌细胞显色强度计分：0分细胞无显色；1 分呈浅黄色(弱染色)；2 分呈棕黄色(中等染色)；3分呈棕褐色(强染色)。两项相加>3分记为阳性，≤3分记为阴性。

1.4 统计学方法 数据采用SPSS 11.5软件进行统计学处理，计数资料进行χ2检验，相关性分析采用Spearman法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTEN、p-Akt、Snail及E-cadherin在肝癌组织中的表达 PTEN的阳性部位位于细胞的胞质，阳性细胞呈巢状或散在分布(图1)，HCC中PTEN阳性表达率为46.25%(37/80)；p-Akt的阳性部位为胞核和胞浆(图2)，在HCC中p-Akt的阳性表达率为42.50%(34/80)；Snail蛋白在HCC中以胞核和胞浆阳性为主(图3)，阳性表达率为33.75%(27/80)；E-cadherin的阳性部位为细胞膜和少许细胞质(图4)，阳性表达率为67.50%(54/80)。

图1 PTEN在HCC中的表达(EnVision ×400)

图2 p-Akt在HCC中的表达(EnVision ×400)

图3 Snail在HCC中的表达(EnVision ×400)

图4 E-cadherin在HCC中的表达(EnVision ×400)

2.2 PTEN、p-Akt、Snail及E-cadherin的表达与临床病理特征的关系 PTEN、p-Akt、Snail及E-cadherin蛋白表达与临床病理特征的关系见表1，可见PTEN蛋白的表达与病理分级、肿瘤直径、CLIP评分、侵袭性及包膜情况相关(P<0.05或P<0.01)。p-Akt、E-cadherin的表达亦与病理分级、肿瘤直径、CLIP评分、侵袭性及包膜情况相关(P<0.05或P<0.01)，其中p-Akt的表达率随着病理组织级别、肿瘤直径、CLIP评分及侵袭性的升高而表达率增高，而E-cadherin表达模式相反，随着病理组织级别、肿瘤直径、CLIP评分及侵袭性的升高而表达率降低，同时p-Akt在包膜不完整的肿瘤中的表达率高，而E-cadherin在包膜完整的肿瘤中的表达率高。Snail的表达与肿瘤直径、CLIP评分、侵袭性及包膜情况相关(P<0.05或P<0.01)，但与肿瘤病理分级无关(P>0.05)。

2.3 PTEN与p-Akt、Snail及E-cadherin表达的相关性 经Spearman相关分析显示，HCC组织中PTEN 的表达与p-Akt的表达呈负相关(r=-0.696，P<0.05)，与Snail的表达呈负相关(r=-0.291，P<0.05)，与E-cadherin的表达呈正相关(r=0.537，P<0.05)。而Snail的表达与E-cadherin的表达呈负相关(r=-0.464，P<0.05)。

表1 HCC组织中PTEN、p-Akt、Snail及E-cadherin的表达与临床病理特征的关系

3 讨论

抑癌基因PTEN是被发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，在肝癌的研究中，已证实PTEN基因的表达缺失与HCC的发生发展密切相关[7]。本研究通过免疫组化检测PTEN在原发性肝癌组织中的表达，结果发现PTEN在HCC中的阳性表达率为46.25%，其表达与病理分级、肿瘤直径、CLIP评分、侵袭性及包膜情况均相关，表明PTEN的表达缺失与肝癌恶性进展、高侵袭性相关。PTEN是PI3K/AKT途径最强的负性调控子，能拮抗PI3K/AKT信号系统，导致磷酸化Akt减少，阻断AKT活化及其下游激酶的活性。本研究对PI3K/AKT途径中的下游调控因子——磷酸化Akt(p-Akt)的检测也证实了这一过程： HCC组织中PTEN 的表达与p-Akt的表达呈负相关，表明在HCC组织中PTEN的表达缺失使AKT的活化失去抑制作用，活化的AKT表达增加，使PI3K/AKT通路处于持续活化状态，造成细胞增殖加快，促进肿瘤的恶性进展。

HCC的高侵袭、高转移特性是患者生存期短、死亡率高的重要原因；在肝癌组织中，EMT也是其高侵袭、高转移的重要机制之一。本研究通过检测肝癌患者肝组织中上皮表型E-cadherin的表达和E-cadherin的抑制剂、转录因子Snail的表达，发现E-cadherin和Snail的异常表达与肝癌恶性进展、高侵袭性相关，表明肝癌的进展与其上皮细胞极性的丧失、间质特性的获得相关。

研究表明，EMT 与多种信号通路的激活有关，其中PI3K-AKT是重要的发生途径之一。在该通路中，活化的AKT可以通过激活E-cadherin的转录抑制因子Snail，进而抑制E-cadherin的转录，造成上皮表型的丢失和细胞间质化的发生[2]。本研究结果发现，PI3K-AKT通路中负性调控子PTEN的表达与肝癌组织中上皮表型E-cadherin的表达呈正相关，均随着肿瘤恶性程度的增加而表达下降，而与间质标志物Snail的表达呈负相关，进一步证实PI3K-AKT途径参与了肝癌EMT的发生过程，PTEN的表达缺失导致通路持续激活是重要的因素之一。

总之，本研究结果表明肝癌的恶性进展可能与抑癌基因PTEN的表达缺失有关，进而使PI3K/AKT途径中AKT的活化失去抑制作用，造成该通路持续活化，促进了HCC恶性进展，同时由于PI3K/AKT途径在EMT发生中的重要作用，PTEN的表达缺失导致的PI3K/AKT通路活化也是肿瘤发生EMT、促进肿瘤转移、增强侵袭性的重要原因之一。因此，今后围绕PTEN基因开展肝癌的基因治疗，提高肿瘤组织中PTEN的表达，有望成为抑制肝癌恶性进展、提高患者生存率的新手段。

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Expression of PTEN and p-Akt in Hepatocelluar Carcinoma and Their Relationship with Epithelial-mesenchymal Transitions

Zhang Yong1,Tang Xiaoyu1,Li Rongqing1,Feng Xudong1,Zhang Yanhua1,Wang Li2

1.Department of Radiation Oncology,the First Affiliated Hospital to Kunming Medical University,Kunming,Yunnan,650032,China,2.Department of Pathology,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To investigate the expression of PTEN and p-Akt in hepatocelluar carcinoma(HCC)and the correlation between PTEN and epithelial-mesenchymal transition(EMT)in HCC malignant progression.Methods Immunohistochemical Envision method was applied in detecting the expressions of PTEN,pAkt,E-cadherin and Snail in 80 cases with HCC and the correlation among them was analyzed.Results The positive expression rate of PTEN,pAkt,E-cadherin and Snail in HCC was 46.25%(37/80),42.50%(34/80),67.50%(54/80)and 33.75%(27/80),respectively.The expression rates of PTEN and E-cadherin decreased in HCC malignant progression while the expression rates of pAkt and Snail increased;related analysis by Spearman pointed out that there existed a negative correlation between the expression of PTEN and those of pAkt and Snail(r=-0.696 and -0.291，P<0.05),while a positive correlation between the expression of PTEN and that of E-cadherin(r=0.537，P<0.05);there existed a negative correlation between the expression of Snail and that of E-cadherin(r=-0.464，P<0.05).Conclusions The defective expression of PTEN leads to a continuous activation of PI3K/AKT pathway that further promotes the occurrence of EMT,which may be of relationship with HCC malignant progression;to increase the expression of PTEN may be a hopeful new approach in antagonizing EMT and inhibiting the malignant procession of HCC.

hepatocelluar carcinoma(HCC);PTEN;epithelial-mesenchymal transition(EMT);expression

国家自然科学基金项目(81201759)；云南省应用基础研究项目(2012FB210)

650032 昆明，昆明医科大学第一附属医院肿瘤放疗科(张 勇，汤小玉，李荣清，冯旭东，张燕华)；成都军区昆明总医院病理科(王 丽)

王 丽，电话:0811-774212；E-mail:2001wl@163.com

R 735.7

A

1004-0188(2014)04-0349-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.04.001

2014-03-02)