杨树农杆菌介导遗传转化中抗生素浓度的筛选

冯连荣 张兴芬 尹 杰 宋立志 赵继梅 彭儒胜 矫丽曼 张 妍

(辽宁省杨树研究所，辽宁 盖州 115200)

杨树农杆菌介导遗传转化中抗生素浓度的筛选

冯连荣 张兴芬 尹 杰 宋立志 赵继梅 彭儒胜 矫丽曼 张 妍

(辽宁省杨树研究所，辽宁 盖州 115200)

研究头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢拉啶、头孢他啶4种头孢类抗生素对根癌农杆菌LBA4404和EHA105的抑制作用；以欧美杨111和盖杨组培苗为材料，研究卡那霉素(Km)对2种杨树叶片分化及茎段生根的影响，并分析头孢噻肟钠对欧美杨111叶片分化及茎段生根的影响。结果表明，头孢噻肟钠、头孢曲松钠和头孢他啶对LBA4404具有良好的抑菌效果，使用浓度为50 mg/L，其中头孢噻肟钠对农杆菌EHA105的抑菌效果最好，头孢拉啶抑菌效果较差。不同杨树品种对卡那霉素的耐受性差异不大，欧美杨111在叶片转化筛选培养时，使用浓度为10 mg/L，抗性芽生根阶段为20 mg/L；盖杨在叶片转化筛选培养时，卡那霉素使用浓度为20 mg/L，抗性芽生根阶段为 25 mg/L，头孢噻肟钠对欧美杨111叶片分化和茎段生根影响不大。

杨树；抗生素；根癌农杆菌；抑菌效果；遗传

目前杨树(Populusspp.)遗传转化方法主要有农杆菌介导法、PEG(聚乙二醇)法、电激法和基因枪法等[1-2]，其中农杆菌介导法因其转化方法简单、效率高等特点已成为杨树主要的遗传转化方式[3]。在农杆菌介导的杨树遗传转化过程中，使用抑菌抗生素能及时有效地抑制或杀死农杆菌的生长，以防止其危害植株组织并影响植株再生[4]。同时需要利用植物表达载体上所携带的抗性标记基因，使用抗生素筛选被转化细胞。因此，开展不同抗生素对农杆菌的抑菌效果试验以及外植体对抗生素的敏感性试验是成功建立杨树遗传转化体系的前提条件。

本研究在建立欧美杨(P.×euramericana)111和盖杨(P.×gaixianensis)叶片再生植株优化体系的基础上，分析了4种头孢类抑菌抗生素对根癌农杆菌LBA4404和EHA105的抑菌效果，以及抗生素对组培叶片不定芽分化及组培苗生根的影响。以确定适合欧美杨111和盖杨的抑菌抗生素种类和浓度及选择抗生素浓度，为开展根癌农杆菌介导的欧美杨111和盖杨遗传转化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验植物材料与菌株

植物材料为欧美杨111和盖杨组培苗；根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株为LBA4404和EHA105，质粒为rd29A+pROKⅡ+VaCBF3，抗性标记基因为卡那霉素(Kanr)。

1.2 试剂

4种国产医用头孢类抗生素，其中头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢他啶为悦康药业集团有限公司生产；头孢拉啶为上海新先锋药业有限公司生产；卡那霉素购自Sigma公司；其他试剂为国产分析纯。

1.3 培养基

欧美杨111叶片分化培养基为：MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂 6 g/L；盖杨叶片分化培养基为：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂6 g/L；欧美杨111生根培养基为：1/2MS+IBA 0.4 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L；盖杨生根培养基为：1/2MS+IBA 0.3 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L；农杆菌培养采用LB固体和液体培养基。

1.4 试验方法

1.4.1 头孢类抗生素对农杆菌的抑制试验 抗生素浓度设置为：0(CK)、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L。挑取农杆菌单菌落接种于5 mL LB液体培养基中，28 ℃，200 r/min振荡培养过夜，取0.5 mL菌液接种至50 mL的LB液体培养基中继续振荡培养至菌液OD600值为0.5时吸取60 μL菌液滴于加有抗生素的LB平板上，用涂布棒均匀涂抹至菌液被充分吸收，于28 ℃恒温培养箱中倒置培养，培养5 d后观察农杆菌生长情况。

1.4.2 不同浓度卡那霉素下欧美杨111和盖杨叶片分化状况 选取颜色正常、充分展叶的欧美杨111和盖杨无菌苗叶片，沿主脉剪1～2刀，接种至含有卡那霉素的分化培养基中，卡那霉素浓度设置为0(CK)、5、10、15、20、25、30、35、40 mg/L，每个浓度设3个重复，每周更换1次培养基，3周后观察叶片分化情况。

1.4.3 不同浓度卡那霉素下欧美杨111和盖杨茎段生根状况 选取生长较一致且健壮的欧美杨111和盖杨茎段，切成长度为2～3 cm，将茎段移入附加不同浓度的卡那霉素的生根培养基中，卡那霉素浓度设置为0 (CK)、5、10、15、20、25、30、35、40 mg/L，每个浓度设3个重复，观察茎段生根及生长状况。

1.4.4 不同浓度头孢噻肟钠下欧美杨111叶片分化及茎段生根状况 头孢噻肟钠浓度设置为0(CK)、50、100、200、400、600、800 mg/L。选取颜色正常、充分展叶的欧美杨111无菌苗叶片，沿主脉剪1～2刀，接种至含有头孢噻肟钠的分化培养基中，每个浓度设3个重复，每周更换1次培养基，3周后观察叶片分化情况。选取生长较一致且健壮的欧美杨111茎段，切成长度为2～3 cm，将茎段移入加有不同浓度的头孢噻肟钠生根培养基中，每个浓度处理设3个重复，观察茎段生根及生长状况。

2 结果与分析

2.1 头孢类抗生素对农杆菌的抑制作用

4种头孢类抗生素对农杆菌不同菌株的抑制试验结果见表1。

由表1可知：4种抗生素对农杆菌LBA4404抑制作用差别不大，头孢噻肟钠、头孢曲松钠和头孢他啶在浓度为50 mg/L时可以抑制其生长，而头孢拉啶在浓度为100 mg/L时也可以完全抑制其生长。4种抗生素对农杆菌EHA105的抑制作用差异明显，其中头孢噻肟钠对其抑制效果最好，在50 mg/L时即可完全抑制EHA105的生长；头孢曲松钠和头孢他啶对农杆菌EHA105的抑制效果差别不大，浓度分别为300 mg/L和350 mg/L时可以完全抑制其生长，而头孢拉啶在浓度为500 mg/L时尚不能完全抑制农杆菌生长，仍有大量菌落长出。所以结合4种抗生素的抑菌效果来看，可以选择头孢噻肟钠作为农杆菌LBA4404和EHA105的抑菌剂，使用浓度为50 mg/L。

表1 头孢类抗生素对农杆菌的抑制试验结果

注：+++代表农杆菌成片，分不出单菌落；++代表单菌落数量较多，少数成片；+代表单菌落数量较少，零星分布；-代表未见单菌落出现。

2.2 卡那霉素对2种杨树叶片分化的影响

卡那霉素对欧美杨111和盖杨叶片分化具有明显的抑制作用，均表现出随浓度增加抑制作用增强的趋势，结果见表2。欧美杨111叶片对卡那霉素比较敏感，在卡那霉素浓度为10 mg/L时叶片褪绿发黄，未见膨大，叶片分化能力完全被抑制。盖杨叶片对卡那霉素也比较敏感，在卡那霉素15 mg/L时盖杨叶片发黄且部分出现干枯，分化率仅为26.7%，而在卡那霉素浓度为20 mg/L时则完全抑制叶片分化。因此，利用欧美杨111作为转化受体材料时，叶片分化时卡那霉素使用浓度为10 mg/L；利用盖杨作为转化受体材料时，叶片分化时卡那霉素使用浓度为20 mg/L。

表2 不同浓度卡那霉素下2种杨树叶片的分化状况

2.3 卡那霉素对2种杨树茎段生根的影响

卡那霉素对欧美杨111和盖杨茎段生根具有较明显的抑制作用，表现出随浓度增加抑制作用增强的趋势，结果见表3。对照组欧美杨111茎段全部生根，生根率为100%，且主根长数量多，有须根；当卡那霉素浓度为15 mg/L时生根率明显下降为12.5%，组培苗长势不好，叶褪绿；浓度为20 mg/L时茎段基部稍膨大，不能生根。盖杨在卡那霉素浓度为20 mg/L时生根率明显下降为8.3%，组培苗长势不好，叶褪绿；25 mg/L时茎段基部稍膨大，不能生根，且组培苗长势渐差，叶片发黄。因此，以欧美杨111作为转化受体材料时，茎段生根时卡那霉素的使用浓度为20 mg/L；以盖杨作为转化受体材料时，茎段生根时卡那霉素的使用浓度为25 mg/L。

表3 不同浓度卡那霉素下2种杨树茎段的生根状况

2.4 头孢噻肟钠对欧美杨111叶片分化及茎段生根的影响

头孢噻肟钠对欧美杨111叶片分化和茎段生根有一定的影响，结果见表4。在设置的头孢噻肟钠各个浓度下欧美杨111均可分化，在50 mg/L时叶片分化率可达100%，分化芽多；随着浓度的增加，叶片分化率有所下降，在浓度为800 mg/L时，分化率为11.1%，叶片分化芽少。欧美杨111茎段在头孢噻肟钠各个浓度下，均可生根，在浓度为50 mg/L时生根率达100%，生出主根长、粗壮，且须根多；随着浓度的增加，生根率有所下降，在浓度为800 mg/L时生根率仅为33.3%，生出主根短，须根少。结合农杆菌对头孢噻肟钠的敏感性试验，选择头孢噻肟钠作为农杆菌的抑菌剂，使用浓度为50 mg/L是可以的。

表4 不同浓度头孢噻肟钠下欧美杨111叶片分化及茎段生根状况

3 结论与讨论

在农杆菌介导的外源基因遗传转化过程中一般需要经过预培养、农杆菌侵染、共培养、脱菌选择培养、转基因植株再生等多个环节，在共培养结束后，需要用抗生素及时有效地抑制或杀死农杆菌的生长，并利用抗性筛选基因在合适的选择压下筛选转化细胞[5]。

目前，进行杨树遗传转化常用的抑菌抗生素主要为头孢类抗生素[6]。本试验通过对4种头孢类抗生素对根癌农杆菌LBA4404和EHA105的抑菌作用分析显示：不同菌株的农杆菌对头孢类抗生素敏感性不同，农杆菌LBA4404较农杆菌EHA105对头孢类抗生素更为敏感，低抗生素含量时(50～100 mg/L)即可完全抑制其生长。农杆菌EHA105对4种抗生素的敏感性不同，其中头孢噻肟钠对EHA105抑制作用最强，在浓度为50 mg/L时可完全抑制其生长，而头孢拉啶浓度为500 mg/L时，农杆菌仍可大量生长。4种抗生素对农杆菌EHA105抑菌效果为：头孢噻肟钠>头孢曲松钠>头孢他啶>头孢拉啶，因此可选择头孢噻肟钠作为农杆菌的抑菌剂。

卡那霉素是植物遗传转化中常用的抗生素[7-8]，本试验使用目的基因质粒具有卡那霉素抗性标记基因，所以选择卡那霉素作为选择抗生素。不同杨树品种卡那霉素使用浓度不尽相同，小黑杨(P.simonii×P.nigra)、欧美杨的敏感性试验中卡那霉素使用浓度分别为40 mg/L和30 mg/L[6,9]。本研究中，欧美杨111和盖杨对卡那霉素的敏感性不同，但差异不大。试验确定欧美杨111和盖杨在农杆菌介导的遗传转化过程中，选择培养各阶段卡那霉素使用浓度为：欧美杨111叶片转化筛选培养时使用浓度为10 mg/L，抗性芽生根阶段使用浓度为20 mg/L；盖杨在叶片转化筛选培养时使用浓度为20 mg/L，抗性芽生根阶段使用浓度为25 mg/L。

选择农杆菌抑菌剂时要考虑其对植物叶片分化及茎段生根的影响。有试验表明，头孢噻肟钠对欧美杨108、山杨(P.dovidiana)和山新杨(P.davidiana×P.bollena)等叶片分化及茎段生根影响不大[10-12]。本试验分析了头孢噻肟钠对欧美杨111叶片分化及茎段生根的影响。试验表明，其对欧美杨111叶片分化及茎段生根影响不大，在浓度为800 mg/L时叶片仍可分化，茎段仍可生根。所以选择头孢噻肟钠作为农杆菌抑菌剂，使用浓度可选择50 mg/L。

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(责任编辑 张 坤)

Study on Screening the Concentration of Antibiotics ofAgrobacteriumtumefaciensMediated Transformation inPopulus

FENG Lian-rong, ZHANG Xing-fen, YIN Jie, SONG Li-zhi, ZHAO Ji-mei,PENG Ru-Sheng, JIAO Li-man, ZHANG Yan

(Liaoning Provincial Institute of Poplar, Gaizhou Liaoning 115200, China)

The inhibitory effects of four antibiotics (Cefotaxime Sodium, Ceftriaxone Sodium, Cefradine, Ceftazidime) onAgrobacteriumtumefaciensLBA4404 and EHA105 were analyzed. The tissue culture plantlets ofP.×euramericanaandP.×gaixianensiswere chosen as the materials to study the effects of kanamycin on leaf differentiation and stem rhizogenesis ofP.×euramericanaandP.×gaixianensis. Besides, the effects of Cefotaxime Sodium on leaf differentiation and stem rhizogenesis ofP.×euramericanaalso was analyzed. The result showed that Cefotaxime Sodium, Ceftriaxone Sodium, Ceftazidime had antibacterial effect onAgrobacteriumtumefactionsLBA4404, and the working concentration was 50 mg/L. Among them, the antibacterial effect of Cefotaxime Sodium was the best forAgrobacteriumtumefactionsEHA105, and the effect of Cefotaxime Sodium was the worse. The tolerance of differentPopuluson kanamycin was similar. ForP.×euramericana, the 10 mg/L concentration of kanamycin was ideal to screen leaf differentiation culture, while the concentration was 20 mg/L in rooting-stage. The concentration of kanamycin was 20 mg/L when leaf differentiation culture ofP.×gaixianensiswas screened, and the concentration was 25 mg/L in rooting-stage. ForP.×euramericana, the effect of Cefotaxime Sodium on the leaf differentiation and stem rhizogenesis was small.

Populus; antibiotics;Agrobacteriumtumefactions; inhibiting effect; genetic

2013-11-27

辽宁省科学公益事业研究基金项目(2011005007)资助；国家林业局林业行业公益性科研专项(200904040)资助。

10.3969/j.issn.2095-1914.2014.04.006

S792.119

A

2095-1914(2014)04-0031-05

第1作者：冯连荣(1983—)，女，硕士，工程师。研究方向：杨树转基因育种及病虫害防治。Email：fenglianrong@163.com。