橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因HbCP2的克隆与表达特性分析

邹 智 刘建汀 庄美露 杨礼富

(中国热带农业科学院橡胶研究所，农业部儋州热带作物科学观测实验站，海南 儋州 571737)

橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因HbCP2的克隆与表达特性分析

邹 智 刘建汀 庄美露 杨礼富

(中国热带农业科学院橡胶研究所，农业部儋州热带作物科学观测实验站，海南 儋州 571737)

根据EST和基因组序列设计引物，应用RT-PCR技术从橡胶树的根组织中分离到1条长 1 056 bp的cDNA，该序列包含了 1 023 bp的开放读码框(ORF)，17 bp的5’ UTR和16 bp的3’ UTR；ORF预测编码340个氨基酸，理论分子量为37.52 kD，等电点为5.25，属于液泡定位的分泌型蛋白；蛋白含有1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域，隶属于木瓜蛋白酶C1家族；蛋白与蓖麻、杨树中同源蛋白的相似性均在80%以上，将基因命名为HbCP2。表达分析显示，在所分析的根、树皮、木质部、芽、叶片、叶柄和乳管等组织中，HbCP2仅在根中被检测到，表现出明显的组织特异性。

橡胶树；半胱氨酸蛋白酶；根特异性表达

半胱氨酸蛋白酶是一类活性位点含有亲核半胱氨酸残基的蛋白水解酶，也称为巯基蛋白酶。根据蛋白的结构特征和进化关系，半胱氨酸蛋白酶可分为木瓜蛋白酶C1、天冬氨酸内肽酶C13、胱冬肽酶C14、钙依赖半胱氨酸蛋白酶C2、泛素C端水解酶C12和泛素特异蛋白酶C19六大家族，其中以木瓜蛋白酶研究较多[1]。在植物中，半胱氨酸蛋白酶广泛参与种子萌发、幼苗发育、组织分化、衰老、细胞程序性死亡和各种胁迫应答等生物学过程[1-2]。橡胶树(HeveabrasiliensisMuell.Arg.)是一种原产于亚马逊河流域的热带雨林乔木，鉴于其重要的经济价值而在东南亚,中国和非洲等部分国家和地区广为种植。迄今，橡胶树中仅报道了1个半胱氨酸蛋白酶编码基因——HbCP1(DQ642886)，该基因在乳管中的表达丰度明显高于树皮和叶片，且受割胶和乙烯利诱导[3]。基于EST和基因组序列，本研究从橡胶树的根中克隆到一个根表达的HbCP2基因，通过对其序列特征和表达特性进行分析，以期为下一步的功能研究与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1 基因克隆与表达分析所用材料 橡胶树无性系热研7-33-97的组培苗由中国热带农业科学院橡胶研究所育种课题组提供，装袋栽于大棚，选择长势一致、均具有4个叶蓬、且最上层叶片完全绿化的植株，待下层叶片出现明显黄化后(即用SPAD-502便携式叶绿素测定仪测得最底层叶片的叶绿素含量约降为最上层叶片的1/2)，分别采集根、树皮、木质部、芽、4个叶蓬的叶片、最上层叶片的叶柄和叶柄的胶乳(乳管细胞的细胞质成分)作为试验材料。

1.1.2 菌株和质粒 大肠杆菌菌株JM109由本实验室保存，克隆载体pMD18-T购自Takara公司。

1.1.3 酶、试剂盒及生化试剂 胶回收试剂盒购自Promega公司；小型质粒提取试剂盒、反转录试剂盒、TaKaRa LATaq、T4-DNA连接酶、限制性内切酶及其他工具酶均购自大连宝生物工程有限公司和基因公司；IPTG、X-Gal等生化试剂为进口或国产分析纯，PCR引物的合成和基因的序列测定委托北京三博远志生物有限责任公司完成。

1.2 分析方法

1.2.1 总RNA的提取和cDNA第一链的合成 叶柄胶和其他组织总RNA的提取分别参照邹智等的研究方法[4-5]；cDNA第一链的合成参照PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒说明书。

1.2.2 基因克隆 以从根转录组文库(未发表)中筛选到的EST作为查询序列，应用BLASTn程序[6]同源搜索橡胶树的基因组序列(RY7-33-97品系为，未发表)，然后根据序列信息，采用Primer 5在基因编码区的两侧设计引物对HbCP2F(5’AGCTACCACCATTCCTCATGGAG 3’)和HbCP2R(5’ACTGCTATCTTGAAC TTCATGCAGTGG 3’)。以反转录的cDNA为模板进行PCR 反应，反应体系为：1 μL cDNA模板，5 μL 10×PCR buffer，5 μL 25 mmol/L MgCl2，8 μL 2.5 mmol/L dNTP，0.5 μL 20 μmol/L HbCP2F，0.5 μL 20 μmol/L HbCP2R，0.5 μL 5 U/μL LATaq，加ddH2O至50 μL。用PE9700 PCR 仪进行PCR 反应，反应条件为：94 ℃预变性3 min，然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.0 min，35个循环，最后72 ℃延伸5 min。吸取5 μL PCR产物与1 μL 6×loading buffer混匀后用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳后，经溴化乙锭(EB)染色，再紫外成像检测。PCR产物挖胶回收后连接到pMD18-T上，用热击法导入JM109感受态细胞后，进行蓝白斑筛选、PCR验证、质粒酶切电泳后，取处于对数生长期的阳性菌液1 mL用400 μL 4℃预冷的50%甘油保存，委托北京三博远志生物有限责任公司用M13+/M13-进行双向测序。

1.2.3 基因序列的生物信息学分析 多序列比对和进化树的构建采用ClustalW2[7]和MEGA 4.0[8](用Neighbor-Joing法，bootstrap值设为 1 000)；蛋白的一级结构分析采用ProtParam和ProtScale( http://web.expasy.org/)；保守结构域分析采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)；翻译后修饰采用MotifScan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)；亚细胞定位分析采用TargetP 1.1软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/)和SignalP 4.1软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；跨膜结构域的预测采用TMHMM 2.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。

1.2.4 基因的表达特性分析 根据测序结果，设计引物对HbCP2Fq(5’GCCTAACGACTGGGGCTAAT 3’)和HbCP2Rq(5’GCGACAGCCTTCATTAGTGC 3’)；以18SrRNA(18SF:5’GCTCGAAGACGATCAGATACC 3’；18SR: 5’TTCAGCCTTGCGACCATAC 3’)作为参照基因，进行半定量分析，72 ℃延伸时间设为20 s，目的基因和18S的扩增循环数分别设为25个和18个。

2 结果与分析

2.1 基因克隆结果分析

在前期构建的橡胶树的根转录组文库中(未发表)，获得了1条 1 238 bp的EST，该序列包含 1 023 bp的ORF，其编码蛋白与其他植物的半胱氨酸蛋白酶同源。通过将序列及原始Read比对到橡胶树的基因组(未发表)上，发现基因的转录区全长 1 317 bp(其与先前报道的RRIM600基因组的对应区域存在8个SNP差异)，含有1个长度为90 bp的内含子，而EST 的3’端存在8 bp的多A加尾序列。

以HbCP2F和HbCP2R为引物、根反转录的cDNA作为模板进行PCR扩增，成功获得1条近1 000 bp的清亮条带(图1)。测序结果表明，除不含内含子序列外，PCR扩增到的序列与基因组的对应区域仅存在2个碱基的差异(图2)，但均没有影响编码蛋白。

2.2 基因序列的生物信息学分析

2.2.1HbCP2基因及其编码蛋白的一级结构分析 序列分析表明，HbCP2编码区的GC含量为46.53%，预测编码340个氨基酸，理论分子量(Mw)为37.52 kD，等电点(pI)为5.25，pH 7.0时的带点荷数(ch)为-8.49；就氨基酸组成而言，在构成该蛋白的20种氨基酸中，丙氨酸(Ala)含量最高(10.9%)，甘氨酸(Gly)次之(10.0%)，组氨酸(His)含量最低(1.5%)；就构成氨基酸的理化特性而言，该蛋白包含36个强碱性氨基酸(K,R)，45个强酸性氨基酸(D,E)，108个疏水氨基酸(A,I,L,F,W,V)和94个极性氨基酸(N,C,Q,S,T,Y)，脂肪族指数(AI)为62.65，不稳定系数(Ⅱ)为20.00；该蛋白的总平均亲水性(GRAVY)为-0.451，除N-端外，蛋白的其他区域主要表现为亲水性。

2.2.2 HbCP2蛋白保守结构域分析 结构域搜索显示，HbCP2含有1个Inhibitor_I29(39～96位，PF08246，E值为6.55×10-24)和1个Peptidase_C1( 123～339 位，PF00112，E值为9.23×10-122，包含保守的半胱氨酸、组氨酸和天冬氨酰活性位点)结构域(图3)。

2.2.3 HbCP2蛋白翻译后修饰、亚细胞定位及跨膜结构域分析 MotifScan分析显示，HbCP2蛋白的19～24、133～138、142～147、186～191、204～209、215～220、272～277位和307～312位为N-豆蔻酰化位点；54～60位为酪氨酸磷酸化位点；29～32、34～37、92～95、125～128、169～172、180～183、222～225、240～243位和280～283位为酪氨酸蛋白激酶II磷酸化位点；98～100、164～166位和222～224位为蛋白激酶C磷酸化位点；119～122位为天冬氨酰糖基化位点；141～152位为巯基蛋白酶半胱氨酸活性位点；282～292位为巯基蛋白酶组氨酸活性位点；299～318位为巯基蛋白酶天冬氨酰活性位点。

TMHMM显示，HbCP2蛋白的N端含有1个跨膜螺旋，其中7～26位为跨膜区。TargetP和SignalP分析表明,HbCP2是一个分泌型蛋白，其中1～27位信号肽，其酶切位点在26和27位之间(图3)。

2.2.4 HbCP2蛋白的同源比对与进化分析 同源分析表明，HbCP2与蓖麻(Ricinuscommunis，XP_002531151，XP_002531152)、杨树(Populustrichocarpa，XP_002306369)中同源蛋白的相似性均在80%以上，而与拟南芥(Arabidopsisthaliana)SAGH12(AT5G45890)和橡胶树CP1(BG33750)的相似性也分别为61%和50%，显示出较高的保守性(图3～4)。

2.3HbCP2基因的表达特性分析

以相同浓度的反转录cDNA(包括根、树皮、木质部、芽、叶片、叶柄和乳管，由于HbCP2在拟南芥中的同源基因AtSAGH12主要在衰老叶片中特异表达，因而,本研究专门分析了不同时期的衰老叶片)作为模板，用内参基因18SrRNA及目标基因HbCP2的定量引物分别进行PCR扩增，结果显示，18S的表达比较稳定，而HbCP2仅在根组织中被检测到(图5显示了基因在根和4个叶蓬叶片中的转录水平)。

3 结论与讨论

半胱氨酸蛋白酶广泛存于各类动物、植物和微生物中，因其在蛋白质降解及氮素循环利用中的重要作用而备受关注。本研究报道了1个全新的橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因——HbCP2，虽然该基因在核酸水平与已经报道的HbCP1[3]无明显同源，但在蛋白水平上，两者的相似性高达50%。与HbCP1蛋白一样，HbCP2包含1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域，隶属于木瓜(Chaenomeles sinensis)蛋白酶C1家族，但HbCP2的序列长度(340aa)比HbCP1(457aa)短，同时缺乏HbCP1N端的RTX和C端的GRAN结构域。进化分析表明，HbCP2与拟南芥半胱氨酸蛋白酶中AtSAGH12的相似性最高。AtSAGH12是一个典型的衰老相关基因[9-10]，主要在拟南芥的衰老叶片和花中表达，然而，HbCP2的表达模式与AtSAGH12明显不同，显示出根特异表达特性：首先，研究试图以基因克隆引物HbCP2F和HbCP2R对来源于根、树皮、木质部、芽、叶片(考虑到基因可能只在衰老叶片中表达，研究特异选取了具有4个叶蓬的植株，分析了完全绿化的叶片、叶绿素已减半的衰老叶片以及居于中间的2蓬叶片)、叶柄和乳管组织的cDNA进行PCR扩增，结果只有在根组织中得到了扩增。然后，研究又以定量引物HbCP2Fq和HbCP2Rq进行PCR，得到类似的结果；最后，研究又同源搜索了橡胶树已公布的芽、胶乳、树皮、叶片的转录组数据[11-14]，同样未能找到同源读段(read)，这表明HbCP2确实是一个根特异表达的基因(至少在本研究所分析的各种组织中)。生物信息学分析显示，HbCP2蛋白的不稳定系数<40，总平均亲水性<0，且N端含有一段与AtSAGH12类似分泌型的信号肽，而AtSAGH12为液泡定位蛋白[15]，这表明HbCP2为液泡定位、稳定的亲水性蛋白。总之，虽然HbCP2极有可能行使AtSAGH12类似的功能，但其组织特异性进化是否赋予其新的功能或生物学意义还有待进一步研究。

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(责任编辑 张 坤)

Molecular Cloning and Expression Analysis of a Cysteine Proteinase Gene (HbCP2) fromHeveabrasiliensis

ZOU Zhi, LIU Jian-ting, ZHUANG Mei-lou, YANG Li-fu

(Danzhou Investigation & Experiment station of Tropical Crops, Ministry of Agriculture/Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou Hainan 571737, China)

Based on the EST and genome sequences, a 1 056 bp cDNA was isolated from the root tissue ofHeveabrasiliensiswith specific primers via RT-PCR. The sequence contains a 1 023 bp long open reading frame (ORF), 17 bp 5′UTR and 16 bp 3′UTR. The ORF was predicted to encode 340 amino acids with a theoretical molecular weight (Mw) of 37.52 kD and isolectric point (pI) of 5.25; The sequence was predicted to be a secretory protein located to vacuoles; the protein contains one Inhibitor_I29 domain and one Peptidase_C1A domain and can be categoried as the papain C1 family; the protein shares a similarity of more than 80% with the homologues in castor bean (Ricinuscommunis), poplar (Populustrichocarpa), and then this gene was designated asHbCP2. Semi-quantitative RT-PCR analysis showed thatHbCP2 exhibits a root-specific expression pattern in examed tissues, i.e. root, bark, xylem, bud, leaf, petiole and laticifer.

Heveabrasiliensis; cysteine proteinase; root-specific expression

2013-11-13

国家自然科学资金(31371556)资助；海南省自然科学基金(312026)资助；中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费专项(1630022011014)资助。

杨礼富(1968—)，男，研究员。研究方向：分子生物学。Email:ylfri@126.com。

10.3969/j.issn.2095-1914.2014.04.005

S718.46

A

2095-1914(2014)04-0026-05

第1作者：邹智(1982—)，男，助理研究员。研究方向：分子生物学。Email:zouzhi2008@126.com。