HgCl2 和84 消毒液在月季组培中消毒效果的研究

朱淑新

（衡水学院，河北衡水 053000）

1 材料与方法

月季茎段采自衡水学院校园内绿化带选取当年生木质化枝条。

1.1 材料的处理及试验方法

1.1.1 配置培养基。培养基为MS（蔗糖25g/L+琼脂条7.5g/L，pH 值5.8～6.0）培养基。

1.1.2 取材。选取1 年生的月季枝条，剪去顶部和基部，并去除叶片及叶柄，用清水冲洗数次，用枝剪截成长1～2cm 茎段（每个茎段上至少有1 个叶芽），放置大烧杯中用清水浸泡30min 后将清水倒出，再将茎段用70%乙醇溶液浸泡30s 后倒出溶液。

1.1.3 试验设计。0.1%HgCl2处理月季茎段，浸泡时间分别为9min、13min、15min、18min、25min，共5 个处理，重复3 次；20%84 消毒液处理茎段，浸泡时间分别为5min、15min、30min、45min，共4 个处理，重复3 次。

1.1.4 接种。在超净工作台上，将每个处理的月季枝条接种到培养皿上，每个培养皿接种3 个茎段。

1.2 培养条件

此试验在衡水学院生物系楼组培试验室中进行，将接种好的培养皿置于组织培养室中，光照强度为2000Lx，光照时间为10～12h，温度为25℃±2℃，10d后观察生长情况，并统计污染的茎段、无菌的茎段，以及茎段死亡的情况，并计算污染率、无菌率和死亡率。

2 结果与分析

2.1 不同处理时间20%84 消毒液对月季茎段消毒效果的影响

从表1 可以看出，利用70%乙醇处理30s 后，用20%84 消毒液处理月季茎段，随着处理时间的不断加长，茎段污染率呈直线下降趋势，而无菌率恰好相反。以20%84 消毒液处理5min 后，茎段污染率最高，达66.67%，无菌率最低，为33.33%；主要是由于处理时间较短，未彻底消灭外植体上细菌的缘故。而20%84 消毒液处理45min 后，茎段污染率最低，为13.33%，无菌率最高，达86.67%；且各处理时间均无死亡现象。

表1 20%84 消毒液对月季茎段消毒效果的影响

2.2 不同处理时间的0.1% HgCl2 溶液对月季茎段消毒效果的影响

从表2 可以看出，利用70%乙醇处理30s 后，用0.1%HgCl2溶液处理月季茎段，随着处理时间的不断加长，茎段污染率呈下降趋势，无菌率呈上升趋势，且较平缓。用0.1%HgCl2溶液处理7min 后，茎段污染率最高，为36.67%，无菌率最低，为63.33%；而以0.1%HgCl2处理18min 后消毒效果最佳，茎段污染率最低，为0，无菌率最高，达98.33%。用0.1%HgCl2溶液处理月季茎段的各时间处理中都有少量枝条死亡的现象。用0.1%HgCl2溶液处理外植体，处理7min 后的污染率最高，是由于消毒不彻底所致；当处理时间加长时，污染率降低、成活率下降，是由于HgCl2自身毒性影响，将外植体表面的微生物彻底杀死的同时，也破坏了外植体组织和表层细胞[1]，导致外植体死亡。

表2 0.1%HgCl2 溶液对月季茎段消毒效果的影响

2.3 不同种消毒液对月季茎段消毒效果的影响

从表3 可以看出，利用70%乙醇处理月季茎段30s 后，分别用20%84 消毒液和0.1%HgCl2溶液处理，用20%84 消毒液处理月季茎段45min，有8 段被污染，52 段未被污染，无菌率达86.67%，死亡数为0段；用0.1%HgCl2处理月季茎段18min 有0 段被污染，59 段未被污染，无菌率高达98.33%，死亡数为1 段。在消毒效果方面来看，0.1%HgCl2溶液处理18min 的消毒效果更好。通过方差分析比较，用20%84 消毒液处理45min 和用0.1%HgCl2处理18min 对月季茎段的消毒效果差异显著。从时间方面来看，用0.1%HgCl2溶液处理18min 后的消毒效果比20% 84 消毒液处理45min 后的消毒效果要好，说明0.1%HgCl2溶液具有高效性。但是用0.1%HgCl2溶液处理月季茎段18min时无污染茎段，出现死亡现象。原因是HgCl2溶液毒性较大，具有较高的杀伤性，不仅将外植体表面的微生物彻底杀死了，还伤害了外植体组织和表层细胞[1]。用0.1%HgCl2溶液对月季茎段消毒时间再次加长，月季茎段的死亡数目可能还会增加，不利于试验所要达到的预期效果，影响试验数据的正确性，从而影响试验结果的确定性。

表3 不同种消毒液对月季茎段消毒效果的影响

3 结论与讨论

3.1 结论

应用0.1%HgCl2和20%84 消毒液对月季进行不同时间段的消毒处理试验表明：20%84 消毒液处理月季茎段45min 消毒效果较佳，无菌率达86.67%；0.1%HgCl2溶液处理月季茎段18min 的消毒效果最佳，无菌率达98.33%。通过方差分析比较，用20%84 消毒液处理45min 和用0.1%HgCl2处理18min 对月季茎段的消毒效果差异显著。但由于HgCl2溶液毒性较大，出现月季茎段死亡现象

3.2 讨论

植物组织培养受光照时间、光照强度、湿度、培养基等多方面的因素影响，在试验过程中会遇到很多问题。试验操作前要对操作台及其它试验用具（比如镊子）进行一定时间的消毒处理，保证接种室十分清洁。在进行试验操作时，要注意配制的母液要及时使用，植物材料长期暴露在室外会影响试验的准确性；每接种一段外植体都要把镊子放在酒精灯上方用外焰烤几秒消毒后，再接种下一段外植体；接种完一个培养皿，镊子都要放在一个特定的地方，操作一段时间后要对操作台进行消毒处理，避免人为的操作失误影响试验结果，预防接种苗出现玻璃化、褐化[1]等现象。植物组织培养试验对操作过程要求十分严格，每一个环节操作不当都可能造成试验失败。本试验第1 次采取校园外绿化带里的月季枝条，试验数据很不理想，出现严重死亡现象；第2 次采用校园内的月季枝条，经同样的操作步骤，试验数据较为理想，可以进行统计分析，为以后的科研工作提供理论依据。两次试验出现较大差异，是因为校外绿化带长期在充满汽车尾气以及粉尘的环境中生长，月季受到严重污染，表层附着着诸多污染物，甚至内部也已遭到一定程度破坏，影响试验结果；校内的月季洁净，易于清理，对试验影响较小，在进行科研工作时，要选择洁净的试验材料，得到的数据才会更加准确。

用20%的84 消毒液处理月季枝条45min，无菌率仅为86.67%，还不是最好的消毒时间，实验还需要进一步设计更多的时间梯度，比如说50min、55min 等时间梯度，找出最好的消毒时间。

用70%乙醇处理茎段的时间不同，得出的结论也不尽相同。王洪兴[1]进行君子兰的组培试验，该研究摸索出君子兰的最佳消毒方法是利用70%乙醇处理40s后，利用NaClO 处理20min。类比得出，用70%乙醇处理月季茎段40s 效果会更好。

利用HgCl2虽然消毒效果较好，但是药品本身毒性比较大，有时会因为浸泡时间过长破坏了外植体表层甚至内部组织的活性，并且废液会对环境保护造成较大影响，在利用0.1%HgCl2溶液对外植体消毒试验时，需要谨慎操作，要合理处理废液。

在植物组织培养科研工作中，每一步操作都要严谨地进行，消毒液的选用尤为重要，理想的消毒剂应具备杀菌谱广、杀菌能力强、效果稳定性好、毒性低、刺激性小（最好是无毒、无残留、无刺激），且易溶于水，对人和动物安全及廉价易得[2]。在今后的科研工作中，有关科研单位应根据市场需求情况和要求，从合理复配、合成新化合物、生产工艺等多角度、多方位研发新型消毒剂，从而提高我国消毒剂的科技含量，对植物组培技术有更近一步的研究，建立更好的再生体系，向社会提供更好的产品。