鲜牛乳中掺杂非蛋白氮及非乳蛋白的检测研究

李美桃，王波，葛冬梅

(徐州市产品质量监督检验中心，江苏 徐州 221000)

0 引 言

我国现行乳品标准中测定蛋白质质量浓度以凯氏定氮法为主[1]。凯氏定氮法实际上是测定总氮量的一种方法，只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质质量浓度。然而在实际测定过程中，被测物的组成是否为蛋白质是很难判定的，所以当被测物里加入一些含氮量高的物质时，会使被测物的蛋白质含量大大“提高”[2-6]。三聚氰胺事件就是一个很好的例证。2008年发布的GB/T 21704-2008《乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定》标准可以测定样品中非蛋白氮的质量浓度[7]，但不能判定蛋白质来源。本课题利用氨基酸分析仪对鲜牛乳中的游离氨基酸及水解氨基酸进行分析，以确定牛乳中氨基酸质量浓度及比例组成，选出1种或多种氨基酸作为特征氨基酸，结合凯氏定氮法测定鲜牛乳中的粗蛋白质量浓度，用以辨别鲜牛乳中的蛋白质来源。

1 材料与方法

1.1 样品

本次实验未搀假牛乳样品由江苏徐州绿健乳品有限公司提供。

1.2 仪器与试剂

日立L-8900氨基酸分析仪、自动凯氏定氮系统(FOSS2800)，浓盐酸、氢氧化钠、浓硫酸等均为分析纯

1.3 方法

1.3.1 牛乳中蛋白质的测定

GB 5009.5-2010《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[1]

1.3.2 鲜牛乳中氨基酸的测定[8-14]

(1)牛乳水解氨基酸试样制备。准确吸取2 mL牛乳样品于玻璃水解管中，加入2 mL浓盐酸，将水解管与真空泵连接抽真空，酒精喷灯封口，110℃水解22～24 h，待水解管冷却后开管，将溶液转入圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪将样品蒸干，除去浓盐酸，用浓度为0.02 mol/L的盐酸稀释定容，最后经孔径为0.45 μm的滤膜过滤后上机待测。

(2)牛乳游离氨基酸试样制备。吸取适量牛乳，用0.02 N的盐酸稀释定容，经孔径为0.45 μm的滤膜过滤后待测。

(3)牛乳氨基酸的分析。使用氨基酸自动分析仪对上述样品处理液进行分析。

仪器分析条件：4.6 mm×60 mm，填料为3 μm磺酸型阳离子树脂分离柱；缓冲液流速0.4 mL/min，反应液流速0.35 mL/min，柱温57℃，标准样品浓度2 nmol/20 μL，每个样品分析时间40 min。

表1 鲜乳中游离氨基酸的组成 g/100L

2 结果与分析

2.1 鲜牛乳和水解动植物蛋白中游离氨基酸的分析

对鲜牛乳中的游离氨基酸进行分析，结果如表1所示。鲜牛乳中的游离氨基酸总量为0.10～0.25 g/L，质量浓度较低，其中谷氨酸质量浓度最高，其次为丙氨酸、精氨酸和赖氨酸。由表1可以看出，鲜牛乳中游离氨基酸总量以及各种氨基酸质量浓度虽有所差别，但各氨基酸之间的比例以及各氨基酸占总氨基酸的比例是比较固定的，基本在一个比较小的范围内浮动，天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸占总氨基酸的质量分数均超过了5%，但赖氨酸和组氨酸在不同样品中质量浓度差别较明显，说明这两种氨基酸质量浓度不是非常稳定或者在测定过程中受其他因素影响较大，因此这两种氨基酸不适合做特征氨基酸。另外，甘氨酸、赖氨酸和蛋氨酸有可能出现外源加入的情况，因此这3种氨基酸也不适合作为特征氨基酸。谷氨酸质量浓度较高，且稳定性较好，可以作为特征氨基酸的首选。由表1可知，5种不同鲜牛乳样品中甘氨酸/谷氨酸分别为0.092，0.088，0.091，0.089，0.088，这个比值还是比较稳定的。

水解植物蛋白(HVP)和水解动物蛋白(HAP)中的游离氨基酸的测定结果如表2所示。

由表2可以看出，蛋白水解液中游离氨基酸的质量浓度较高，达到120.6 g/L以上，远远高于牛乳中游离氨基酸的质量浓度，是牛乳中游离氨基酸的500倍左右，因此如果在生牛乳中加入蛋白水解液，其中游离氨基酸的质量浓度将大幅度的提高，因此可以通过检测鲜牛乳中游离氨基酸的质量浓度来鉴别，鲜乳中是否添加了蛋白水解液。蛋白水解液中各类氨基酸的质量浓度高低与鲜牛乳存在一定的差异，蛋白水解液中质量浓度较高为谷氨酸、甘氨酸和脯氨酸，而牛乳中游离氨基酸中以谷氨酸最多,其次为丙氨酸、精氨酸和赖氨酸，二者在游离氨基酸的组成上差异较大，因此可以从游离氨基酸的质量浓度和组成上来分析是否添加了蛋白水解液等游离氨基酸高的非乳蛋白成分。

表2 水解动植物蛋白中各种氨基酸质量浓度 g/L

2.2 鲜牛乳中蛋白质和水解氨基酸的分析

氨基酸是构成真蛋白的单位，利用盐酸水解的方法，将鲜牛乳中的真蛋白水解，通过水解后各种氨基酸的质量浓度确定水解蛋白即真蛋白的质量浓度，同时与凯氏定氮法测定的粗蛋白质量浓度对比，获得各鲜牛乳中真蛋白占总蛋白的质量分数，如表3所示。

表3 鲜牛乳样品中粗蛋白和水解蛋白含量

由表3可知，利用凯氏定氮法测得的鲜牛乳总蛋白质质量浓度在3.0～3.5 g/100 mL之间，满足国家相关标准鲜牛乳中蛋白质质量浓度在2.9～3.5 g/100 mL之间的要求，同时发现通过盐酸水解获得各鲜牛乳样品的水解氨基酸总量与总蛋白质质量浓度相差不大，占粗蛋白质量分数的95%以上，这不仅说明了鲜牛乳中几乎所有含氮化合物均为乳蛋白，也说明了盐酸水解较彻底，可以得到相对理想的蛋白质水解产物。

鲜牛乳样品通过盐酸水解和氨基酸自动分析仪分析获得的谱图如图1所示。

利用盐酸水解并通过氨基酸分析仪分析可以准确测定鲜牛乳中真蛋白质量分数，同时与凯式定氮法测定的蛋白质质量分数相比较，利用酸水解蛋白占粗蛋白的质量分数初步判断鲜牛乳中是否添加类似三聚氰胺的假蛋白[15]。

通过图1的鲜牛乳水解氨基酸分析谱图可以看出，17种氨基酸的分离效果较好，说明此法可以较准确地获得各种水解氨基酸质量浓度。利用氨基酸自动分析仪对盐酸水解后5个鲜牛乳样品进行测定分析，分析数据见参考文献[15]，发现鲜牛乳水解后的17种氨基酸中，谷氨酸的质量分数最高，占总量的22%左右，质量分数在5%～10%的氨基酸包括：天冬氨酸、丝氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸，半胱氨酸检测出的质量分数最低，仅有1.9%左右，这有可能是鲜牛乳中的本身含量低，但也可能是酸水解时，部分半胱氨酸被破坏，因此在选择特征性氨基酸时，尽量不予以考虑。综合氨基酸的质量分数和稳定性，选择天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和精氨酸作为鲜牛乳水解氨基酸的特征性氨基酸。当人为添加非乳蛋白时，通过水解蛋白分析比较，这些特征性氨基酸的质量分数会发生较大变化，由此可以作为判定添加非乳蛋白的依据。

2.3 分析结果的验证

为验证分析结果的准确性和可靠性，将同一牛乳分成若干份，分别添加不同质量浓度的三聚氰胺、甘氨酸和蛋白水解液进行测定，测定结果统计如表4所示。

由表4可以看出，当在牛乳中添加不同质量浓度的三聚氰胺时，随着三聚氰胺质量浓度的加大所测到的蛋白质质量浓度也在逐步提高，而总的氨基酸质量浓度却基本保持不变。当添加20 mg/L的三聚氰胺时，氨基酸总量与蛋白质质量分数的比值还保持在95%以上，当三聚氰胺添加量增大到50 mg/L时，该比值已经降低到94.2%；当三聚氰胺添加量增大到500 mg/L时，该比值已经降低到87.5%，已经比较明显的发生了变化。对于三聚氰胺来讲，当添加量达到50 mg/L时，我们通过氨基酸总量与粗蛋白质的比值就可以准确判断出是否添加了非蛋白氮。

表4 鲜乳中添加不同物质检测结果统计结果

当蛋白水解液的质量浓度逐步加大时，游离氨基酸总量迅速上升，但甘氨酸和谷氨酸的比值变化幅度不是太大，处在一个相对稳定的范围之内。因此，当游离氨基酸质量浓度升高而其他氨基酸质量浓度相对稳定时，基本上可以断定出该样品中添加了蛋白水解液类的物质。

当鲜乳中游离氨基酸质量浓度和水解氨基酸总量均正常的情况下，则以某种氨基酸和谷氨酸之比来进行判定。鲜乳中甘氨酸和谷氨酸之比正常应不高于0.1，超出该范围则有可能加入甘氨酸。同样，赖氨酸、蛋氨酸与谷氨酸之比一般不应高于0.45和0.2。由表4可以看出，甘氨酸的添加量由20 mg/L逐步增加到500 mg/L时，甘氨酸的质量浓度明显增加，同时甘氨酸和谷氨酸的比值也明显变大，由0.11增大到1.54。由此可见，即使添加了很少量的甘氨酸(＜100 mg/L)，虽然游离氨基酸总量没有超过250 mg/L的上限，但是甘氨酸与谷氨酸的比值已经大于0.1，此时仍可以根据比值判断出添加了甘氨酸。

3 结 论

(1)以水解氨基酸总量作为真蛋白含量，真蛋白/粗蛋白应该在95%以上。低于95%时，可能有非蛋白氮(比如三聚氰胺、尿素等)加入；

(2)鲜乳中游离氨基酸质量浓度应低于25 g/100 L，当游离氨基酸总量大于25 g/100 L时，则可能有水解蛋白(如皮革水解物、毛发水解物等)或单体氨基酸(如甘氨酸)加入；当某种氨基酸质量浓度高于25 g/100 L，且其他氨基酸含量正常时，则可能有单体氨基酸加入；

本研究暂未对其他蛋白(例如：大豆蛋白)进行分析，因此暂时无法辨别添加到牛乳中的其他蛋白，但根据研究结果，可以将天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和精氨酸作为乳品水解氨基酸的特征性氨基酸，以便进行下一步的研究。另外，本研究所采集的鲜牛乳均来自徐州地区，因为奶牛品种、生长环境及喂饲方式等因素影响，可能存在区域性差异。

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