牛奶中蛋白酶活力测定的方法比较

杨旭，屈小玄，郭庆贺，兰雪萍，吕远平

(四川大学食品工程系，成都 610065)

0 引 言

蛋白凝块现象是牛奶储存过程中较为常见的质量问题[1，2]。研究表明，蛋白凝块是由牛奶中的蛋白酶水解乳蛋白生成肽、氨基酸所引起的[3-5]。为了控制蛋白酶引起的质量问题，需要对牛奶中蛋白酶活力进行测定。

酱曲、糙米、豆粕等的蛋白酶活力测定已有成熟的方法[6-8]，而牛奶中蛋白酶活力的测定始终没有统一的标准和方法。据文献报道，采用的测定方法有甲醛法[9]、邻苯二甲醛衍生法[10]和福林试剂法[11]，但对于不同测定方法的比较却鲜有报道。

本研究选用福林法、邻苯二甲醛衍生法和甲醛法这三种方法对牛奶中蛋白酶活力进行测定，评价选择出更适合牛奶中蛋白酶活力的测定方法，为生产控制和产品质量检测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售UHT利乐砖纯牛奶；福林试剂，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，酪素(化学纯)，无水碳酸钠，三氯乙酸，十二烷基磺酸钠(SDS)，四硼酸钠(分析纯)，邻苯二甲醛(化学纯)，-巯基乙醇(分析纯)。

1.2 仪器与设备

TU-1901紫外可见分光光度计，LD4-2A低速离心机，HWS-26电热恒温水浴锅，78HW-1恒温磁力搅拌器，XK96-A快速混匀器，PHS-3C pH计。

1.3 方法

1.3.1 福林法测定牛奶中蛋白酶活力

参考GB/T 23527-2009的方法略作修改[12]。此方法原理是蛋白酶在一定的温度和pH下能够水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸如酪氨酸，在碱性条件下与福林试剂反应，生成钼蓝与钨蓝，通过紫外分光光度计测定，从而计算出蛋白酶的活力[13]。

分别取不同质量浓度的酪氨酸标准溶液(0，10，20，30，40，50 mg/L)各1 mL，加入浓度为0.4 mol/L的碳酸钠溶液5 mL，福林试剂溶液1 mL，显色反应在(40±0.2)℃中持续20 min。将反应液取出后，在680 nm下测定其吸光度。根据酪氨酸不同浓度对应的吸光度值绘制标准曲线。

取1 mL待测牛奶样品，加入10 g/L的酪素溶液1 mL，在(40±0.2) ℃下反应10 min，取出静置后过滤。再取滤液1 mL，与5 mL的碳酸钠溶液、1 mL的福林试剂混合后，在(40±0.2) ℃下显色20 min，于680 nm下测定其吸光度。空白组测定方法相同，只是在加入酪素之前先加入三氯乙酸使蛋白酶失活。牛奶中蛋白酶活力为

X=AK×4/10，

式中：X为牛奶样品的蛋白酶活力(u/mL)；A为牛奶样品的吸光度；K为吸光常数(即根据回归方程计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量)；4为反应试剂的总体积；10为反应时间。

1.3.2 邻苯二甲醛衍生比色法测定牛奶中蛋白酶活力

参考Church[14]和张艳[10]的方法略作修改。此方法的原理是邻苯二甲醛衍生试剂在碱性介质中与游离氨基酸反应生成异吲哚衍生物，在340 nm下有特征吸收，通过测定吸光度计算出牛奶中游离氨基氮的浓度，以此反映出蛋白酶的活力。

将40 mg的邻苯二甲醛溶于1 mL甲醇中，分别加入25 mL浓度为100 mmol/L的四硼酸钠、2.5 mL10%的SDS、100 L的 -巯基乙醇，加水定容至50 mL，即为邻苯二甲醛衍生试剂(OPA)。

分别取不同浓度的苯丙氨酸标准溶液(0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 mmol/L) 各150 μL， 加入3 mL的OPA试剂，室温下反应2 min，340 nm下测定其吸光度值。根据苯丙氨酸不同浓度对应的吸光度绘制标准曲线。

取10 mL待测的牛奶样品在4 000 r/min下离心分离20 min，以脱去脂肪。取脱脂后的牛奶样品2.5 mL，分别加入5 mL质量分数为12%的三氯乙酸、0.5 mL蒸馏水，在2 000 r/min下离心15 min。取清液150 μL，加入3 mL的OPA试剂，室温下反应2 min，340 nm下测定其吸光度值。根据苯丙氨酸标准曲线计算出牛奶中游离氨态氮的浓度。

1.3.3 甲醛法测定牛奶中蛋白酶活力

采用康小红[9]的方法并进行修改。此方法是通过测定牛奶中氨基酸态氮的质量浓度来反映蛋白酶的活力。其原理是利用了氨基酸的两性作用，甲醛能够固定氨基的碱性，使氨基酸的羧基显示出酸性，通过氢氧化钠标准溶液滴定来定量，以酸度计测定滴定终点。

具体方法：取60 mL待测的牛奶样品于200 mL锥形瓶中，开动磁力搅拌器，用浓度为0.05 mol/L的氢氧化钠标准溶液进行滴定，至pH值为8.2时记下消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数，此数据可反映出牛奶中的总酸质量浓度。加入10 mL甲醛溶液后，再用浓度为0.05 mol/L的氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH值为9.2，记下此时消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数，以此计算出牛奶样品中氨基酸态氮的质量浓度。以水为空白对照。牛奶样品中氨基酸态氮的质量浓度按以下公式计算：

式中：X为牛奶样品中氨基酸态氮的质量浓度；V1为牛奶中加入甲醛后消耗的氢氧化钠标准溶液的体积；V2为空白组加入甲醛后消耗的氢氧化钠标准溶液的体积；V3为牛奶样品的取用量；c为氢氧化钠标准溶液的浓度。

2 结果与分析

2.1 福林法测定牛奶中蛋白酶活力的结果

以酪氨酸为标准品，根据酪氨酸不同浓度所对应的吸光度值绘制标准曲线，如图1所示。所得标准曲线的回归方程为y=0.01043x-0.00714，R2=0.9975，式中y为吸光度，x为酪氨酸浓度。

在680 nm下测定牛奶空白对照组和试验组的吸光度值，根据回归方程计算牛奶中蛋白酶活力，结果见表1。为了验证方法的重现性，进行四次重现性试验，测定的牛奶中蛋白酶活力分别为1.4291，1.3905，1.4291，1.4291 u/mL，运用统计学相关知识对数据进行分析，结果如表2所示。此方法的平均相对误差为0.0102，相对标准偏差为0.0136，说明福林法的精确度高，数据的重现性好。而且每次测定时同一牛奶样品的平行值重复性好。从测定结果可以看出，反应后牛奶吸光度的微小变化也会引起测定结果的改变，说明此方法的灵敏性很高。向牛奶样品中分别加入不同量的酪氨酸标准溶液，测定回收率以确定福林法的准确度，结果如表3所示。福林法的回收率在96.19%～99.05%之间，平均回收率为97.54%，相对标准偏差为0.0120，表明福林法的准确度高，符合分析标准。

表1 福林法对牛奶中蛋白酶活力的测定结果

表2 福林法测定结果的统计学分析

表3 福林法回收率实验结果

2.2 邻苯二甲醛衍生比色法测定牛奶中蛋白酶活力的结果

以苯丙氨酸为标准品，根据苯丙氨酸不同浓度所对应的吸光度值绘制标准曲线，如图2所示。所得标准曲线的回归方程为y=0.22387x-0.02451，R2=0.9973，式中y为吸光度，x为苯丙氨酸浓度。

在340 nm下测定经过反应后的牛奶的吸光度值，根据回归方程计算牛奶中游离氨基氮的浓度，结果如表4所示。进行了4次重现性验证，测得牛奶中蛋白酶活力分别为0.5 472，0.5 383，0.5 294，0.5 338 mmol/L。由于SDS溶解性受温度的影响较大，不同环境温度引起SDS溶解性变化可能是造成吸光度差异的主要原因，进而对牛奶中蛋白酶活力的测定结果产生影响。通过统计学分析(表5)得出此方法的平均相对误差为0.0104，相对标准偏差为0.0142，说明邻苯二甲醛衍生比色法也具有较高的精确度，结果重现性较好。每次测定时同一牛奶样品的平行值重复性好。从试验结果分析，吸光度的微小变化同样会引起所测蛋白酶活力的变化，说明此方法的灵敏度也很高。向牛奶样品中分别加入不同量的苯丙氨酸标准溶液，测定回收率以确定邻苯二甲醛衍生比色法的准确度，结果见表6。邻苯二甲醛衍生比色法的回收率在94.88%～98.70%之间，平均回收率为96.33%，相对标准偏差为0.0173，表明此方法的准确度高，同样符合分析标准。

2.3 甲醛法测定牛奶中蛋白酶活力的结果

用浓度为0.005 mol/L的氢氧化钠标准溶液进行滴定，分别测定原样品和加入甲醛后的样品消耗氢氧化钠的量，以此计算出牛奶中蛋白酶的活力，测定结果如表7所示。从重现性验证试验的结果来看，甲醛法结果重现性较差，4次测定的氨基酸态氮的质量浓度分别为0.0 308，0.0 325，0.0 333，0.0 306 g/100 mL，且每次滴定时同一牛奶样品消耗氢氧化钠的平行值差异较大。表8为四次重现性试验结果的统计学分析数据，此方法的平均相对误差和相对标准偏差分别为0.1 407和0.040 9，表明相较于福林法和邻苯二甲醛衍生比色法，甲醛法的精确度明显较低。向牛奶样品中分别加入不同量的苯丙氨酸标准溶液，测定回收率以确定甲醛法的准确度，结果见表9。甲醛法的回收率在88.84%～100.25%之间，平均回收率为95.23%，相对标准偏差为0.0497，说明此方法较前两种方法的准确度低。

表4 邻苯二甲醛衍生比色法对牛奶中蛋白酶活力的测定结果

表5 邻苯二甲醛衍生比色法测定结果的统计学分析

表6 邻苯二甲醛衍生比色法回收率实验结果

表7 甲醛法对牛奶中蛋白酶活力的测定结果

表8 甲醛法测定结果的统计学分析

表9 甲醛法回收率实验结果

2.4 3种测定方法的比较

从测定原理来看，福林法、邻苯二甲醛衍生比色法和甲醛法这3种测定蛋白酶活力的方法都是以测定产物氨基酸的量来表示蛋白酶活力。但是，福林法是对蛋白酶分解酪素产生的含有酚基的氨基酸进行测定，以酪氨酸的量来表示牛奶中氨基酸的量，邻苯二甲醛比色法是通过对与邻苯二甲醛衍生试剂反应的游离氨基酸进行测定，以苯丙氨酸的量来表示牛奶中氨基酸的量，甲醛法则是通过消耗碱液的量来测定氨基酸态氮的质量浓度，以氨基酸态氮的质量浓度来表示牛奶中氨基酸的量。3种测定方法和表达方式有所不同，但福林法从原理上能够更为实际地反映出牛奶中蛋白酶的活力。

从检测过程来看，福林法反应条件苛刻，试剂大多需要现配现用，操作复杂；邻苯二甲醛衍生比色法反应时间最短，操作较甲醛法稍显复杂，测定过程中温度对SDS溶解性影响较大，SDS的溶解性对吸光度又有直接影响，因而在测定中对温度的控制增加了操作的复杂性；甲醛法是3种方法中操作最为简便的，反应时间适中。

从测定结果来看，福林法精确度和准确度高，3次重复实验中结果重现性好；邻苯二甲醛衍生比色法精确度和准确度也高，3次重复试验中结果重现性较福林法较差，这可能是由于测定中环境的温度变化引起吸光度的差异；甲醛法精确度和准确度均较低，3次重复试验中结果重现性较差。将3种方法测定的结果进行比较分析，其所测得牛奶中蛋白酶活力的表达方式不同，福林法得到的酶活力单位为u/mL，邻苯二甲醛法得到的酶活力是以每升牛奶中游离氨基氮的毫摩数来表示，而甲醛法测得的酶活力是以100 mL牛奶中氨基酸态氮的克数来表示，很难直接进行数值比较。因此，对牛奶样品进行稀释，分别用3种方法测定稀释后牛奶的蛋白酶活力，结果如表10所示。运用统计学的相关分析(t检验：成对双样品均值分析)对三组数据进行处理，福林法和邻苯二甲醛衍生比色法测定结果的相关系数为0.986，福林法和甲醛法测定结果的相关系数为0.956，邻苯二甲醛衍生比色法和甲醛法测定结果的相关系数为0.983，表明3种方法的变化趋势是一样的，都可以从不同角度反映出牛奶中蛋白酶的活力，结果之间可以进行比较客观的比较。

表10 3种方法对不同浓度的牛奶中蛋白酶活力的测定结果

3 结 论

试验对福林法、邻苯二甲醛衍生比色法和甲醛法这3种测定牛奶中蛋白酶活力的方法进行比较，从相关性结果来看，3种方法均能从不同角度反映出牛奶中蛋白酶活力。福林法虽然操作复杂，但其测定结果能够直接客观的反应出牛奶中蛋白酶活力，精确度、准确度和灵敏度高，重复实验结果的重现性好，适合于牛奶中蛋白酶活力的精密测定；邻苯二甲醛衍生比色法测定的蛋白酶活力是以1 L牛奶中游离氨态氮的毫摩数来表示，精确度和准确度好，灵敏度高，反应时间短，但测定过程中由温度引起的SDS溶解性问题对测定结果影响较大，适合于不同样品间蛋白酶活力的精确比较；甲醛法是以100 mL牛奶中氨基酸态氮的质量来表征蛋白酶活力的，操作简单，但是准确性和精确度都较低，重复实验时结果的重现性不好，适合于粗略性和比较性测定。

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