不同条件对黑曲霉2产纤维素酶活性的影响

王 幸，陈颖妃，林煜丹，何礼安，关洪威，肖相政

（仲恺农业工程学院环境科学与工程学院，广东 广州 510225）

随着经济和社会的发展，固体有机废物产生量不断增长，据资料统计，2009年规模化养殖畜禽粪便产量约为8.37亿吨［1］，2010年我国农作物秸秆产量达7.3亿吨［2］，上述废弃物的随意排放和不合理处置对环境造成巨大压力，亟待解决。农作物秸秆、畜禽粪便等有机废弃物除含有大量的纤维素外，还含有氮、磷、钾及多种微量元素［3］，因此通过科学处理和特殊工艺可将其变废为宝，进行循环利用。目前比较成熟的降解纤维类废弃物的方法是好氧生物处理，利用好氧微生物在有氧条件下纤维素酶的代谢作用，将废物中复杂的有机物分解，进一步将其加工成饲料、有机肥料等［4－5］。目前用于生产纤维素酶的微生物大多为丝状真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属，其中曲霉是公认产纤维素酶最高的菌种之一［6］。黑曲霉2是仲恺农业工程学院自行分离筛选的一株具有产纤维素酶活性的丝状真菌，研究表明，该菌对木薯渣、烟叶渣、园林废弃物等具有较好的降解效果，应用潜力巨大。为进一步提高其产酶效率，本文研究了培养时间、接种菌龄、装液量（通气）、初始pH、底物碳源等条件对产纤维素酶活性的影响，以期为今后推广应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株 黑曲霉2（仲恺农业工程学院环境科学与工程学院保存），以冰箱保存原始菌株为母种，由母种经复壮活化转接的为一代菌种，依此分别为二代、三代菌种。

1.1.2 产酶基础培养基 蔗糖30g，硝酸钠2g，磷酸二氢钾1g，氯化钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁0.01g，水1000mL，自然pH，121℃灭菌30min。

1.1.3 主要试剂 磷酸钠缓冲液（（0.2mol/L，pH6.0）、羧甲基纤维素钠盐（CMC）缓冲液、3，5－二硝基水杨酸（DNS）显色剂、1000μg/mL标准葡萄糖溶液、标准纤维素酶液（广州某化学试剂店购买）。

1.1.4 底物碳源 木薯渣、稻秸、糖泥、中药渣（其中木薯渣、糖泥分别取自广东某淀粉厂和糖厂，中药渣取自广州某制药公司，木薯渣、稻秸、糖泥、中药渣经60℃烘干后磨碎，过60目筛备用）。

1.2 试验方法

1.2.1 纤维素酶活性测定 纤维素粗酶液制备：发酵液经5000r/m离心10min，上清液即为粗酶液。纤维素酶活性测定：参照农用微生物菌剂（GB20287－2006）中纤维素酶活性测定方法［7］，以羧甲基纤维素钠盐作底物，CMC经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能与3，5－二硝基水杨酸作用使硝基还原为氨基，溶液变为橙色，橙色的深度与还原糖浓度成正比，因此通过比色可求得还原糖含量，进而可计算纤维素酶活性。酶活单位：在试验条件下，以每分钟产生1μmol葡萄糖定义为1个酶活力单位［8］。

1.2.2 黑曲霉2种子液制备 将冰箱保存的黑曲霉2置于28℃的生化培养箱活化2h，然后转接于50mL基础培养基中，30℃、200r/min摇床培养24h，备用。

1.2.3 培养时间对黑曲霉2产酶活性的影响 接种5mL黑曲霉2种子液于150mL基础培养基中，30℃、200r/min摇床培养，分别于24h、48h、72h、96h测定纤维素酶活性。

1.2.4 接种菌龄对黑曲霉2产酶活性的影响 参照1.2.2方法，分别以母种、一代菌种、二代菌种、三代菌种制备种子液，然后接种5mL种子液于150mL基础培养基中，48h测定各处理纤维素酶活性。

1.2.5 通气量（装液量）对黑曲霉2产酶活性的影响 以3%接种量分别转接种子液于100mL、150mL、200mL、250mL的基础培养基中，30℃、200r/min摇床培养，测定各处理48h的纤维素酶活性。

1.2.6 pH 对黑曲霉2产酶活性的影响 分别配制pH 值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的基础培养基，然后接种5mL种子液，30℃、200r/min摇床培养，48h测定各处理纤维素酶活性。

1.2.7 不同底物（碳源）对黑曲霉2产酶活性的影响 分别以中药渣、木薯渣、水稻秸秆、糖泥为碳源替代基础培养基中的蔗糖，接种5mL种子液于150mL各培养基中，30℃、200r/min摇床培养，48h测定各处理的纤维素酶活性。

1.3 数据处理

本文数据采用SAS9.0进行统计分析（SAS Institute，Gary，NC，USA）；图表制作采用软件EXCEL 2003（Microsoft Company，USA）

2 结果与分析

2.1 培养时间对黑曲霉2产纤维素酶活性的影响

分别在培养24、48、72、96h取样测定发酵液纤维素酶活性，结果见图1。

图1 培养时间对黑曲霉2产纤维素酶活性的影响

从图1中可以看到，黑曲霉2产纤维素酶具有一定的规律性，酶活随培养时间的延长而增加，48h达到活性高峰，酶活力为938.19μg/mL，随后逐渐降低，至96h下降到45.57μg/mL。试验结果表明48h为黑曲霉2产酶活性高峰，此时菌体生长旺盛。

2.2 接种菌龄对黑曲霉2产纤维素酶活性的影响

接种物菌龄直接影响菌体的生长活性，菌龄越老，菌体活性一般较低。本研究中分别接种母种、一代、二代和三代菌种，并离心测定了菌体湿重，结果见表1。从表中结果可以看到，接种不同菌种影响产酶活性，其总体呈现出随菌龄老化而降低的趋势，接种二代菌种和三代菌种酶活力差别不大，以接种原始菌株产酶活性最高，48h达611.07μg/mL，同时测定的菌丝湿重和酶活性具有一定的相关性，酶活性越高，菌体湿重一般越大。

表1 接种物菌龄对黑曲霉2产纤维素酶活性的影响

2.3 通气量对黑曲霉2产纤维素酶活性的影响

不同装量对纤维素酶活性的影响见表2。从表中可知，不同装液量对纤维素酶活性影响显著，其中以装量150、200mL时酶活性较高，相比100、250mL装量时差异显著，说明黑曲霉2产酶需要一定的通气条件，但并非通气量越大越好，同时菌丝湿重与酶活性表现出较好相关性。

表2 不同装液量对黑曲霉2产纤维素酶活性的影响

2.4 培养基初始pH对黑曲霉2产纤维素酶活性的影响

pH不但影响酶产量，而且影响酶的活性和稳定性。分别调节基础培养基pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，测定发酵液48h的纤维素酶活性，结果见图2。从图中可以看到，黑曲霉2在pH6.5时产酶活性最高，达787.46μg/mL，随着pH增大，纤维素酶活性急剧下降，说明黑曲霉2在中性偏酸的环境条件下生长好，代谢旺盛，产酶量大，与文献报导的黑曲霉适宜生长环境是弱酸性一致［9－10］。

图2 初始pH对黑曲霉2产纤维素酶活性的影响

2.5 不同底物对黑曲霉2产纤维素酶活性的影响

分别采用木薯渣、水稻秸秆、糖泥、中药渣作为碳源替代基础培养中的蔗糖，测定48h的产酶活性，结果见表3。表中数据表明，纤维素酶活性因底物不同而有差异，其中以木薯渣做底物时，活性最高，达761.95μg/mL，其次为中药渣，而以稻秸、糖泥做底物时，产酶活性相对较差，说明在四种有机废弃物中，黑曲霉2对木薯渣的分解能力最强，效果最好。同时从测定的菌体湿重也可看到，其量与酶活性成正比，显示了较好的相关性。

表3 不同底物对黑曲霉2产酶活性的影响

3 结论与讨论

本文系统研究了接种菌龄、培养时间、通气量、初始pH和不同碳源底物对黑曲霉2产纤维素酶活性的影响，确定了黑曲霉2高效产酶的最佳培养条件，即采用原始菌株接种、基础培养基初始pH为6.5、每500mL摇瓶装量为150mL、培养48h条件下产纤维素酶活性最高，为今后工业生产及高效应用提供了技术参数。

纤维素酶是诱导酶，在纤维素酶的生产中选择合适产酶诱导物十分重要。据资料报道，产酶诱导物效力最强的是槐糖［11］，但其价格昂贵，不适合工业生产。本研究中选择了四种有机废弃物做为产酶诱导底物和碳源，其表现出了不同的产酶效果，以木薯渣效果最好，表明黑曲霉2对木薯渣的利用能力最强，适合木薯渣的高效降解。本研究中酶活力测定采用的是液体发酵培养，但目前有机废弃物常用的处理方法是生物堆肥，因此下一步拟对该菌固体发酵产酶条件进行研究，以满足生产的需要。

［1］田宜水.中国规模化养殖场畜禽粪便资源沼气生产潜力评价［J］.农业工程学报，2012，28（8）：230－234.

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［3］汪建飞，于群英，陈世勇，段立珍.农业固体废弃物的环境危害及堆肥化技术展望［J］.安徽农业科学，2006，34（18）：4720－4722.

［4］马怀良，许修宏.畜禽粪便高温堆肥化处理技术［J］.东北农业大学学报，2005，36（4）：536－540.

［5］何川，陈艳乐，蒋林树，崔海峰，叶子弘.农作物秸秆饲料处理技术的研究现状［J］.畜牧与饲料科学，2010，31（10）：26－27.

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［7］沈德龙，李俊，姜昕，等.农用微生物菌剂国家标准（GB20287－2006）.中国国家标准化管理委员会，2006.

［8］Criquet S.Measurement and characterization of cellulase activity in sclerophyllous forest litter.Journal of Microbiologiacal Methods，2002，50（2）：165－173.

［9］蔡凤.黑曲霉产纤维素酶的分离纯化及性质研究［D］.南京：南京理工大学，2006.

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［11］杜连祥.工业微生物学实验技术［M］.天津：天津科学技术出版社，1992，93－100，282.