黑木耳简单快速组织分离新法*

李 晓，孟秀秀，代月婷，黎 倩，黄 兵，胡 欣

(吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130118)

〈育种与驯化〉

黑木耳简单快速组织分离新法*

李 晓，孟秀秀，代月婷，黎 倩，黄 兵，胡 欣

(吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130118)

利用酒精、镊子对黑木耳耳片进行组织分离，方法方便、快捷，分离成功率100%。

黑木耳；干耳片；组织分离

从早期的耳木分离法、孢子弹射分离法培育菌种发展到后来的利用鲜木耳或干耳片分离法[1]培育菌种，木耳菌种的选育工作一直比较繁琐且分离成活率不高。为突破这一难关，笔者经实践，探索出了1种木耳干耳组织分离新技术。此法不仅目标明确、盲目性低，而且兼具取材简单、操作便捷、成活率高等诸多优势。经此法分离培育的菌株菌丝萌发迅速，生长旺盛，浓白粗壮。

1 材料与方法

1.1 分离材料

挑选少筋、无褶皱或少褶皱、无霉、无虫害、6分～8分成熟度的吉Au01单片为实验材料。

1.2 分离工具

镊子、酒精灯、打火机、90 mm培养皿(4个)、75%消毒酒精棉、超净工作台。

1.3 分离培养基

采用常规PDA培养基。其配方为马铃薯(去皮，无芽)200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15 g～18 g(或琼脂条20 g)，水 1 000 mL。培养基在121℃下灭菌30 min后，待温度降至55℃～60℃时出锅摆斜面备用。

1.4 灭菌试剂

将4个培养皿依次编号为1、2、3、4，并分别对4个培养皿按表1进行处理。

表1 灭菌试剂处理

1.5 分离与培养

1.5.1 组织分离

首先，紫外线灭菌。将PDA试管培养基、培养皿等用具放置于超净工作台上，紫外线下灭菌30 min，以杀死大部分杂菌。

然后用75%的酒精棉球擦拭双手及镊子。用镊子将耳片内卷的边缘部分去掉。在耳片上光滑无褶皱的地方夹取约3 mm2(芝麻粒大小)的耳片20块放入1号培养皿中，再同样夹取20块放入3号培养皿中浸泡灭菌。1 min后，用镊子将1号培养皿中的耳片夹入2号培养皿中，3号中的耳片夹入4号中再次浸泡1 min。

最后用灭菌冷却后的镊子夹取耳片从酒精灯火焰上快速穿梭1 s(穿梭时间不宜过长，否则容易烧死耳片)后放入PDA培养基上，盖上胶塞。

1.5.2 分离培养

将分离后的试管置于26℃恒温箱中培养。

1.5.3 纯化培养

分离培养6 d后，挑取生长整齐的前端菌丝块作为接种块接种到PDA培养基上进行纯化培养。

2 结果与分析

组织分离培养2 d后菌丝开始萌发，可看到白色绒毛状菌丝，定期观察污染和菌丝生长情况，菌丝生长整齐、浓白粗壮，符合正常黑木耳菌种特征，分离成功率达100%。结果见表2。

表2 黑木耳组织分离培养记录

注：分离成功率指每个耳片能分离出纯黑木耳培养物的几率。

从表2可以看出，2种方法都能分离出黑木耳，但A方法成活率稍低一点，为25%，且污染中几乎都是细菌污染，B方法基本无污染，既没有细菌污染也没有霉菌污染。这说明75%酒精对霉菌杀菌效果非常好，能杀死耳片上几乎所有的霉菌，但对细菌的杀菌效果不是非常理想，加入青霉素、链霉素后几乎能够杀死全部的细菌。

A方法培养2 d～3 d后菌丝开始萌发。B方法接种后1 d～2 d菌丝全部萌发，并且菌丝洁白粗壮，说明青霉素、链霉素对木耳菌丝不但没有抑制作用，相反还有促进作用，但促进作用的程度还有待进一步研究。

3 小结与讨论

现有的很多木耳菌种的分离方法仍存在许多的不足：如用鲜木耳直接分离或用水润湿后再分离操作繁琐、成活率低；而用氯化汞浸泡分离[2]处理，由于氯化汞有剧毒，对周围环境及木耳菌种都有很大程度的危害，且用氯化汞消毒后需在无菌水中多次冲洗，相当繁琐复杂。

本方法与传统的木耳分离法[1，2]相比，设备简约，成本低廉，操作快速简便，污染率极低(将耳片放入添加了青霉素、链霉素、酒精的溶液中浸泡2个1 min就能迅速彻底灭菌)，克服了胶质菌类组织层较薄、具有一定韧性、不易分离的特点[3]。适用于野生及栽培的多种胶质菌类的菌种分离选育开辟了一条组织分离的新途径，为广大科研工作者及生产者提供了便利。

通过A、B两组对比实验，笔者认为青霉素、链霉素具有极好的抑制细菌生长效果。除将青霉素和链霉素加入到酒精中之外，还可以添加到培养基中[4]。关于青霉素和链霉素用量及浸泡时间等问题还有待进一步研究和探讨。

[1]杜萍，崔宝凯. 木耳菌种分离新方法简介[J].浙江食用菌，2009(6)：27-28.

[2]李云龙，刘柱. 黑木耳的组织分离技术[J].浙江食用菌，2008，16(3)：27.

[3]黄毅.食用菌栽培[M].北京：高等教育出版社，2008.

[4]李晓，刘振钦，刘晓龙，等. 大型经济真菌单孢分离方法的研究[J].吉林农业大学学报，2002，24(3)：41-42.

One Simple and Fast Method onAuriculariaauriculaTissue Isolation

LI Xiao, MENG Xiu-xiu, DAI Yue-ting, LI Qian, HUANG Bing, HU Xin

(Jilin Agricultural University Engineering Research Center of Edible and Medicinal Fungi, Ministry of Education, ChangchunJilin130118)

Ethanol and forceps were used to isolateAuriculariaauriculadry fruit body for tissue culture quickly and conveniently, and the successful rate can go up to 100%.

Auriculariaauricula; Dry fruit body; Tissue isolation

*项目来源：国家现代农业产业技术体系“北方野生菌收集保育与驯化”(GARS-24)；吉林省重大项目“作物秸秆与畜禽粪便高效转化生产食用菌的关键技术研究与示范”(10ZDGG003)。

李晓(1976-)，男，副教授，从事食用菌教学、科研和产业化开发等研究工作。

2014-09-18

S646.6

A

1003-8310(2014)06-0011-02