复合酶法提取金银花多糖及其抗氧化性

周立,刘裕红,贾俊

复合酶法提取金银花多糖及其抗氧化性

周立1*,刘裕红1,贾俊2

1.贵阳职业技术学院,贵州贵阳550000
2.贵阳护理职业学院,贵州贵阳550000

本文旨在优化金银花多糖的复合酶法提取工艺，并评价金银花多糖的抗氧化活性。以不同复合酶(纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶)配比、液料比、pH、酶解温度、酶解时间为试验因素，以金银花多糖得率为考察指标，正交试验筛选复合酶法提取的最佳工艺条件；采用自由基清除能力体系评价金银花多糖的抗氧化活性。结果表明，复合酶最佳配比为纤维素酶2.0%，果胶酶2.0%，木瓜蛋白酶0.5%；复合酶酶解金银花提取多糖的工艺条件为液料比25:1(mL/g)、pH为4.5、酶解温度50℃、酶解时间60 min，在此条件下金银花多糖得率为12.36%；金银花多糖具有较强的抗氧化活性，对DPPH和O2-·自由基的半数抑制浓度分别为0.811 mg/mL、1.363 mg/mL，但与维生素C比较，抗氧化活性较弱。金银花多糖提取工艺方便可行，得率较高，提取到的多糖具有较强的抗氧化活性。

金银花;多糖;复合酶;酶法提取;抗氧化活性

天然植物多糖具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、免疫等生物活性、副作用小等优势，越来越受到研究者的重视[1,2]，如从土茯苓[3]、桃金娘[4]、红雪茶[5]等植物中提取多糖。金银花(Lonicera japonica)属忍冬科，中医认为，金银花可清热解毒、凉散风热，对痈肿疔疮、热毒血痢、喉痹、风热感冒等有一定疗效[6]。对于金银花多糖的提取多采用水提法、超声波法、水提醇沉法，但多糖得率较小，而周小楠等采用纤维素酶法提取金银花多糖，得率可达到11.3%[7]。鉴于酶法可显著提升多糖得率，且未见复合酶法提取金银花多糖及其抗氧活性的相关报道，本试验探讨复合酶提取金银花多糖的最佳工艺条件，同时采用自由基清除能力体系评价其体外抗氧化活性，为金银花多糖的进一步开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

金银花购自中草药市场，烘干至恒重备用；纤维素酶(15 U/mg)上海博奥生物科技；木瓜蛋白酶(650 U/mg)北京奥博星生物技术；果胶酶(500 U/mg)广州齐云生物科技；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、D-无水葡萄糖、维生素C(VC)美国Sigma；浓硫酸、苯酚、三氯乙酸(TCA)等均为分析纯。

UV755B紫外分光光度计深圳瑞鑫达；PHS-3E酸度计上海精科；高速万能粉碎机北京长峰金鼎；电热鼓风干燥箱上海煜南仪器；离心机德国eppendorf；HL-2恒流泵上海沪西；HSY-B双功能水浴恒温摇床金坛市精达仪器。

1.2实验方法

1.2.1 金银花多糖的提取精确称取5.0 g粉碎并过100目筛后的金银花粉，按设定酶解条件(液料比、酶解温度、pH、酶解时间、复合酶配比)，在180 r/min摇床上进行酶解提取实验，得到多糖浸提液。多糖浸提液经90℃高温灭活、离心分离、抽滤浓缩、三氯乙酸法除蛋白、透析除杂、乙醇沉淀、冷冻干燥一系列步骤，最终得到金银花多糖。

1.2.2 多糖含量的测定多糖测定采用苯酚-硫酸法[8]。以葡萄糖(mg/mL)作为标准品测定提取液中多糖液中金银花多糖的含量，葡萄糖标准曲线为y=0.0167x-0.0469，R2=0.9941，式中y为吸光度、x为葡萄糖质量浓度(mg/mL)。金银花多糖得率计算如下：Y(%)=[(A×B)/C]×100，式中：Y为多糖得率(%)；A为由回归方程求得的多糖浓度(mg/mL)；B为多糖液体积(mL)；C为金银花质量(g)。

1.2.3 酶种类对金银花多糖提取的单因素试验参考周小楠等[7]研究结果，固定酶解pH5.0、酶解温度50℃、酶解时间50 min、液料比20:1、摇床转速180 r/min条件不变，分别选取纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶，酶添加量均为1.5%，考察酶种类对多糖得率的影响，以多糖得率为指标并与90℃热水浸提法(时间50 min、液料比20:1)进行比较。

1.2.4 复合酶配比正交优化设计其它条件同1.2.3部分，研究复合酶的不同用量对金银花多糖提取的影响，设计L9(33)正交试验，因素水平设计见表1。

表1 复合酶配比正交试验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of the complex enzyme in orthogonal experimental design

1.2.5 提取条件正交优化设计根据复合酶配比正交实验的实验结果，以料液比、pH、酶解温度、酶解时间为实验因素，设计L9(34)正交试验，研究最优的提取工艺条件，因素水平设计见表2。

表2 提取工艺正交试验设计因素水平表Table 2 Factors and levels of the extraction condition in orthogonal experimental design

1.2.6 金银花多糖体外抗氧化活性测定

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力测定取不同质量浓度的样品溶液2 mL和2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)混匀，反应30 min后在517 nm处测定其吸光度A1，同法测定2.0 mL乙醇加样液的吸光度A2，以及2.0 mL DPPH溶液与2.0 mL蒸馏水的吸光度A0，以VC作为对照[9]。样品对DPPH自由基的清除率计算公式为：Y(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。1.2.6.2 O2-·的清除能力测定取不同质量浓度的样品溶液1.0 mL，加入pH8.2、浓度为50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液4.0 mL，25℃水浴10 min，再加入0.1 mL浓度为25 mmol/L的邻苯三酚，混匀保温5 min后，即刻加入2滴10 mol/L的HCl终止反应，读取溶液在波长325 nm处的吸光度B1，同法测定用蒸馏水代替邻苯三酚后的吸光度B2，及以1.0 mL蒸馏水替代样品溶液后的吸光度B0，以VC作为对照[10]。样品对O2-·的清除率计算公式为：Y(%)=[1-(B1-B2)/B0]×100。

2 结果与分析

2.1酶种类对多糖提取的影响

结果如图1所示，纤维素酶解提取金银花多糖得率10.52%是热水浸提法的2.62倍，且大于木瓜蛋白酶和果胶酶的多糖得率。纤维素酶能够破坏胞壁结构，使胞内和胞壁中的多糖物质溶出，故纤维素酶得率最大。

图1 酶种类对多糖得率的影响Fig.1 Effect of enzymes on the extraction rate of polysaccharide

2.2正交优化试验

2.2.1 复合酶配比试验结果及分析结果见表3，根据极差R值大小（RA＞RC＞RB），影响金银花多糖得率的复合酶顺序为纤维素酶＞木瓜蛋白酶＞果胶酶；空列RD值代表试验误差及交互作用的影响，其中RD＜RA说明纤维素酶是金银花多糖提取的主要影响因素，而RD＞RB、RD＞RC代表果胶酶和木瓜蛋白酶对多糖提取影响不大。正交试验结果确定，复合酶最佳酶配比为A3B3C1，即纤维素酶为2.0%，果胶酶为2.0%，木瓜蛋白酶为0.5%。

表3 复合酶配比正交试验结果Table 3 Results of orthogonal test on the complex enzyme

2.2.2 提取条件试验结果及分析结果见表4，极差分析可知，各因素对金银花多糖得率的影响大小顺序为：A＞C＞B＞D，即液料比对金银花粗多糖提取的影响最大，其次是酶解温度，影响较小的是pH和酶解时间。得出的最佳提取工艺条件为A3B1C2D3，即最佳液料比为25:1，pH为4.5，温度为50℃，酶解时间为60 min。

表4 提取条件正交试验结果Table 4 Results of orthogonal test on the extraction condition

2.3工艺优化后的验证试验

为检验正交试验优化后的工艺可靠性，在上述最佳复合酶配比及最佳工艺提取条件下，进行3组平行试验，所得多糖得率分别为11.85%、12.13%、13.10%，平均值为12.36%。

2.4金银花多糖体外抗氧化活性

2.4.1 多糖对DPPH自由基清除作用由图2可知，随着质量浓度的增加，样品溶液多糖和VC对DPPH自由基清除率不断增大，多糖质量浓度10 mg/mL时，样品溶液多糖对DPPH自由基清除率达到85.37%，具有较强清除DPPH自由基的能力，但比VC清除DPPH自由基的能力差。金银花多糖清除50%DPPH自由基的半数抑制浓度(IC50)为0.811 mg/mL，VC的IC50为0.572 mg/mL。

图2 样品多糖和VC对DPPH自由基的清除作用Fig.2 Scavenging capacity of sample polysaccharide and vitamin C on DPPH free radicals

2.4.2 多糖对O2-·清除作用由图3可知，当浓度达到10 mg/mL时，O2-·的清除率为85.02%，说明金银花多糖具有较强的清除O2-·的能力。VC在质量浓度0.2～10 mg/mL范围内，对O2-·的清除增加较快，0.8 mg/mL清除率达到84.75%，因此金银花多糖与VC相比清除能力较弱，金银花多糖清除O2-·的IC50为1.363 mg/mL，VC的IC50为0.503 mg/mL。

图3 样品多糖和VC对O2-·的清除作用Fig.3 Scavenging capacity of sample polysaccharide and vitamin C on superoxide anion free radicals

3 结论

本研究考察了复合酶配比、酶解pH、液料比、酶解温度及酶解时间对金银花多糖提取的影响。通过单因素试验和正交试验设计确定了纤维素酶、木瓜蛋白酶提取金银花多糖的最佳工艺条件为：纤维素酶添加量2.0%，果胶酶添加量2.0%，木瓜蛋白酶添加量0.5%；液料比25:1、pH为4.5、酶解温度50℃、酶解时间60 min，此条件下多糖得率为12.36%，高于已发表的相关报道，如张玉等水提醇沉法提取金银花多糖，得率为4.87%[11]；赵鹏等采用超声提取，得率仅为3.26%[12]。此外，提取条件中影响金银花多糖得率的因素按主次顺序依次为液料比＞酶解温度＞酶解pH＞酶解时间。

金银花多糖对DPPH自由基和O2-·具有一定的清除作用，并与质量浓度呈正相关关系，当质量浓度达到10 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为85.37%，对O2-·的清除率为85.02%，但与VC比较，金银花多糖清除两种自由基的能力较弱。金银花多糖对DPPH自由基和O2-·的半数抑制浓度(IC50)分别为0.811 mg/mL、1.363 mg/mL。

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Extraction Process of Polysaccharide from Lonicera japonica with Compound Enzyme Treatment and Its AntioxidantActivity

ZHOU Li1*,LIU Yu-hong1,JIAJun2
1.Guiyang Vocational and Technical College,Guiyang 550000,China
2.Guiyang Nursing Vocational College,Guiyang 550000,China

In order to optimize the compound enzymatic extraction technology of polysaccharide from Lonicera japonica and and investigate its antioxidant activity.The experiments used polysaccharides extraction rate as response value,and used enzymatic hydrolysi(cellulose,pectinase,papain),the ratio of water to material,pH,extraction temperature and extraction time as experimental factors to optimize the polysaccharide extraction conditions from Lonicera japonica.Antioxidant activity of polysaccharides was measured by DPPH and O2-·free radical elimination method.The best ratio of compound enzyme was 2.0%cellulase,2.0%pectinase,0.5%papain.The optimum conditions were as follows,the ratio of water to feedstock was 25 mL/g,pH4.5,extraction temperature was 50℃,extraction time was 60 min.Under the optimal conditions, the experimental extraction rate was 12.36%.IC50of DPPH and O2-·were 0.811 mg/mL and 1.363 mg/mL,respectively. Antioxidant activity of sample polysaccharides was weaker than those of vitamin C.The optimum compound enzymatic extraction technology of the polysaccharides from Lonicera japonica was convenient and feasible,the polysaccharides extraction rate was higher than other extraction methods,and the extracted polysaccharides had good antioxidant activity.

Lonicera japonica;polysaccharide;compound enzymes;enzymatic extraction;antioxidant activities

Q539

A

1000-2324(2014)05-0646-05

2012-12-20

2013-02-15

周立(1982-),男,讲师,硕士,主要从事药物质量标准和药物分析.E-mail:inaturet@sina.com

*通讯作者:Author for correspondence.E-mail:inaturet@sina.com