湘潭市汉族女性MTHFR和MTRR基因多态性分布及其与血浆Hcy水平的关系

王淑媛鲁衍强马少杰△ 黄京希杨凯云熊 敏周玉珍杨 琦

湘潭市汉族女性MTHFR和MTRR基因多态性分布及其与血浆Hcy水平的关系

王淑媛1鲁衍强2马少杰2△黄京希1杨凯云1熊 敏1周玉珍1杨 琦3

目的 分析湖南省湘潭市女性5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T、A1298C及甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）A66G位点基因多态性的分布特征，并分析其多态性与血浆同型半胱氨酸（Hcy）水平的关系。方法以湘潭市1 701例女性为研究对象，检测其MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点基因多态性，并对其中110例孕期女性检测其血浆Hcy水平。统计分析本地区基因多态性的分布特征，并与淄博、郑州、烟台、镇江、松滋、惠州、琼海等地区进行比较；分析多态性与血浆Hcy水平的关系。结果湘潭市女性的MTHFR C677T位点TT纯合突变基因型频率为12.6％，高于惠州（10.9％）、琼海（6.1％），低于淄博(43.6％)、郑州(36.8％)、烟台(32.2％)、镇江(21.8％)，差异均有统计学意义。与松滋相比差异无统计学意义。MTHFR A1298C位点CC纯合突变基因型频率为4.8％，低于琼海（7.1％）、高于淄博（1.4％）、郑州（2.4％）、烟台（1.8％）、镇江（3.5％）、松滋（2.6％），差异均有统计学意义。MTRR A66G位点GG纯合突变基因型频率为6.8％，高于淄博（4.8％），低于琼海（9.3％），差异有统计学意义。血浆Hcy浓度与MTHFR C677T位点基因型多态性有关，TT型人群Hcy浓度高于CT型人群和CC型人群（μmol/L: 8.52±2.01 vs 5.94±1.47 vs 5.71±0.18）；血浆Hcy浓度与MTHFR A1298C位点基因型多态性有关，CC型人群Hcy浓度高于AA型人群和AC型人群（μmol/L:9.83±2.26 vs 6.35±2.13 vs 5.55±1.75）；血浆Hcy浓度与MTRR A66G位点基因型无关。结论湘潭市女性MTHFR和MTRR基因多态性频率不同于其他地区，具有地域特异性。MTHFR C677T、A1298C位点多态性与Hcy水平有关。

亚甲基四氢叶酸还原酶；甲硫氨酸合成酶还原酶；基因多态性；同型半胱氨酸

我国是出生缺陷高发国家，出生缺陷总发生率约5.6％[1]。叶酸摄入不足或者不能被人体有效利用是导致出生缺陷的主要原因[2]。研究表明，5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）和甲硫氨酸合成酶还原酶（methionine synthase reductase，MTRR）是叶酸转运和代谢的关键酶[3]。MTHFR基因C677T位点、A1298C位点与MTRR基因A66G位点的多态性会造成MTHFR 与MTRR的酶活性降低，造成叶酸代谢异常，使DNA低甲基化导致唐氏综合征[4]。叶酸代谢障碍会使同型半胱氨酸（Hcy）水平升高，而高同型半胱氨酸（HHcy）与神经管缺陷、唇腭裂、先天性心脏病等出生缺陷[5]，以及复发性流产[6]、妊娠期高血压等孕期疾病密切相关[7]。育龄妇女作为一个特殊的群体，体内叶酸营养素的水平对于胎儿的健康生长发育和孕妇的身体健康都有极其重要的影响。本研究通过检测湘潭市育龄女性体内MTHFR和MTRR编码基因的3个多态性位点，预测受检者的叶酸代谢能力，从而指导孕妇在孕前及孕期适量补充叶酸，维持正常Hcy水平，预防出生缺陷的发生。同时了解湘潭地区妇女叶酸代谢相关基因的分布特点与群体遗传学特征，为本地区预防出生缺陷制定针对性的干预措施提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取湘潭市自2012年11月—2014年2月到我院进行孕前与孕期检查的无亲缘关系女性1 701例，均为汉族，平均年龄（26.72±4.60）岁。

1.2 方法

1.2.1 基因分型检测 经受检者本人知情同意后，采集受检者的口腔黏膜上皮细胞，利用硅胶吸附方法抽提样本的基因组DNA。采用荧光定量PCR技术分别检测分析叶酸代谢相关的3个DNA单核苷酸多态性位点（MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G）。每个反应体系10 μL：包含1 μL浓度为20 mg/L的DNA模板，5 μL Taqman Universal Master Mix，0.5 μL Taqman-MGB探针，3.5 μL去离子水。其中，MTHFR C677T、A1298C与MTHRR A66G具体探针信息见表1，相关仪器、试剂均购自美国ABI公司。反应条件为95℃预热10 min；92℃变性15 s，60℃延伸1 min，20个循环；89℃变性15 s，60℃延伸1 min 30 s；30个循环。反应完成后，用ABI7900型荧光定量PCR仪读取样品的终点荧光，利用分析软件确定各个样本的基因分型结果。

Tab.1 Detection sequences of gene MTHFR and MTRR表1 Taqman-MGB探针所在位置

1.2.2 血浆Hcy水平检测 对其中110例孕期女性检测其血浆Hcy水平。空腹抽取受检查者肘正中静脉血3 mL，注入EDTA抗凝血管，混匀后静置30 min后3 000 r/min离心10 min，分离血清于EP管,采用化学发光法测定Hcy。Hcy检测试剂盒购自德国BAYER公司。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，应用HaploView 4.2软件进行单核甘酸多态性的Hardy-Weinberg平衡、连锁不平衡水平和单倍型结构分析。计量资料以±s表示，比较采用方差分析；计数资料采用例（％）表示，比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡分析 对收集到的湘潭市女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点的检测数据进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，χ2值分别为0.39、0.05和0.19，P＞0.5。说明样本具有本区域群体代表性。

2.2 湘潭市女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点基因多态性分布特点

2.2.1 MTHFR C677T位点基因多态性的分布特点 湘潭市女性的MTHFR C677T位点的TT基因型频率为12.6％，高于惠州、琼海，低于淄博、郑州、烟台、镇江（均P＜0.01）。与松滋相比差异无统计学意义，见表2。

2.2.2 MTHFR A1298C位点基因多态性的分布特点 湘潭市女性MTHFR A1298C位点的CC基因型频率为4.8％，低于琼海，高于淄博、郑州、烟台、镇江、松滋（均P＜0.05）；与惠州差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.2.3 MTRR A66G位点基因多态性的分布特点 湘潭市女性MTRR基因A66G位点的GG基因型频率为6.8％，高于淄博，低于琼海（P＜0.05），与其他地区差异无统计学意义，见表4。

Tab.2 Comparison of MTHFR C677T genotype distribution and frequencies in different areas表2 不同地区汉族女性MTHFR C677T基因型频率分布比较 例(％)

Tab.3 Comparison of MTHFR A1298C genotype distribution and frequencies in different areas表3 不同地区汉族女性MTHFR A1298C基因型频率分布比较 例(％)

Tab.4 Comparison of MTRR A66G genotype distribution and frequencies in different areas表4 不同地区汉族女性MTRR A66G基因型频率分布比较 例(％)

2.3 MTHFR C677T和A1298C两位点连锁情况及单倍型分析 单倍型分析表明，存在4种组合：CA (43.4％)、TA(34.9％)、CC(21.6％)、TC(0.1％)。两位点间存在强连锁不平衡现象（D’=0.986），见表5。

Tab.5 Comparison of MTHFR C677T and A1298C linkage analysis among Han women in Xiangtan city表5 湘潭市汉族女性MTHFR C677T和A1298C连锁型分布 例(％)

2.4 血浆Hcy浓度与MTHFR C677T位点、A1298C位点以及MTRR基因A66G位点基因多态性的关系 3种MTHFR C677T基因型的Hcy水平差异有统计学意义，分别是TT型＞CT型＞CC型（P＜0.05）；3种MTHFR A1298C基因型的Hcy水平差异有统计学意义，分别是CC型＞AA型＞AC型（P＜0.05）。MTRR基因A66G位点不同基因型的血浆Hcy水平差异无统计学意义，见表6。

Tab.6 Analysis of variance of concentration of plasma Hcy and MTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G gene polymorphism表6 3种基因不同基因型的血浆Hcy浓度比较（mol/L，±s）

Tab.6 Analysis of variance of concentration of plasma Hcy and MTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G gene polymorphism表6 3种基因不同基因型的血浆Hcy浓度比较（mol/L，±s）

＊P＜0.05；a与（1）比较，b与（2）比较,P＜0.05

MTHFR C677T基因型CC（1）CT（2）TT（3）F n Hcy n Hcy MTHFRA 1298C基因型AC（1）AA（2）CC（3）Hcy n 4.98±1.76 7.09±3.16 4.98±2.67 2.424 47 46 17 5.71±0.18 5.94±1.47a8.52±2.01ab4.932＊37 68 5 5.55±1.75 6.35±2.13a9.83±2.26ab3.811＊MTRR A66G基因型AA（1）AG（2）GG（3）60 42 8

3 讨论

湖南省是出生缺陷高发区，近十年出生缺陷发生率逐年上升，从2003年的124.33/万到2012年的204.96/万。其中，先天性心脏病占66.89％（第1位），总唇腭裂占12.51％（第4位），神经管缺陷占3.57％（第10位）[15]。遗传因素是出生缺陷的重要影响因素，MTHFR基因C677T位点的多态性会造成其编码的氨基酸发生改变，MTHFR C677T位点为TT基因型是神经管畸形发生的遗传高风险因素，TT基因型比CC基因型人群的MTHFR酶活性下降60％～70％[16]。且MTHFR C677T和A1298C存在协同作用，导致MTHFR酶活性降低，影响叶酸代谢，使Hcy水平升高，与先天性心脏病等多种出生缺陷相关。

MTHFR两位点存在强连锁不平衡，与贵州布依族和苗族人群的报道类似[17]。湘潭市汉族女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点多态性分布与其他地区汉族女性存在差异，可能与人群对不同疾病的易感性有关。MTHFR C677T位点T等位基因频率呈现北方高南方低的趋势，与我国出生缺陷发病率北方高南方低的趋势一致。研究表明，T基因型女性在未服用叶酸增补剂及低叶酸饮食的情况下，其胎儿唇腭裂的发生风险均会增加，若以上两种情况同时存在，则风险进一步增高。反之，如果能够补服叶酸增补剂、提高饮食中叶酸的含量则可以降低胎儿唇腭裂的发生风险[18]。

通过对不同MTHFR和MTRR酶活性组Hcy水平的比较，表明MTHFR的基因多态性导致的酶的活性降低是Hcy水平升高的危险因素。由于基因多态性导致MTHFR酶活性降低后，体内Hcy向甲硫氨酸的转化会受到限制，导致血浆Hcy水平升高。Hcy具有细胞毒性，可以使巯基氧化，细胞内产生大量氧自由基，损伤血管内皮细胞并增加血栓形成的倾向，影响子宫胎盘血流，导致胎儿生长发育的异常。

目前的孕期保健措施是从孕前3个月到孕早期3个月，每天增补叶酸0.4 mg。对于那些由基因多态性造成叶酸代谢障碍的人群，在补充相同剂量叶酸的情况下，红细胞叶酸的浓度较正常人低，Hcy水平明显升高。因此，通过对育龄女性进行遗传筛查，针对存在叶酸代谢障碍的遗传风险人群，采取增加营养素补充、加强红细胞叶酸水平监测、提高产前筛查和孕期管理依从性等干预措施，是有效达到出生缺陷及孕期疾病一级预防目的的重要方法，也是提高人口素质的必要手段。

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（2014-04-25收稿 2014-07-23修回）

（本文编辑 闫娟）

Relationship of Plasma Homocysteine with Gene Polymorphisms of MTHFR and MTRR among Han Women in Xiangtan City

WANG Shuyuan1,LU Yanqiang2,MA Shaojie2△,HUANG Jingxi1,YANG Kaiyun1,XIONG Min1,ZHOU Yuzhen1,YANG Qi3
1 Xiangtan Maternal and Child Health Hospital,Hunan 411100,China；2 Shanghai Institute of Target Molecules；3 National Center for Women and Children’s Health,Chinese Center for Disease Control and Prevention△

E-mail：mashaojie@genechina.com

ObjectiveTo investigate the relationship of plasma homocysteine with the genotype distribution of MTHFR and MTRR among Chinese Han women in Xiangtan.MethodsMTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G genotyping was analyzed to detect the distribution of gene polymorphisms among 1 701 women from Xiangtan city then the data were compared with the rest of the Han women in Zibo,Zhengzhou,Yantai,Zhenjiang,Songzi,Huizhou,Qionghai.Plasma Hcy levels from 110 patients were measured and analyzed the correlation with gene polymorphisms.ResultsThe frequency of MTHFR C677T genotype and allele frequencies in Xiangtan is 12.6％which is higher than Huizhou(10.9％)and Qionghai (6.1％)but lower than Zibo(43.6％),Zhengzhou(36.8％),Yantai(32.2％),Zhenjiang(21.8％)with statistically significant difference(P＜0.05).There is no significant different in MTHFR C677T between Xiangtan and Songzi.The frequency of MTHFR A1298C genotype and allele frequencies in Xiangtan is 4.8％which is lower than Qionghai（7.1％）but higher than Zibo （1.4％），Zhengzhou（2.4％）,Yantai（1.8％）,Zhenjiang（3.5％）and Songzi（2.6％）with statistically significant difference. The frenquency of MTRR A66G genotype and allele frequencies in Xiangtan is 6.8％which is higher than Zibo(4.8％)but lower than Qionghai(9.3％)with statistically signifcant difference.Plasma Hcy concentration correlate with MTHFR C677T, Hcy concentration in TT population is higher than that in CT and CC population（μmol/L:8.52±2.01 vs 5.94±1.47 vs 5.71± 0.18）；Plasma Hcy concentration also correlate with MTHFR A1298C and Hcy concentration in CC population is higher than AA and AC population（μmol/L:9.83±2.26 vs 6.35±2.13 vs 5.55±1.75）；Plasma Hcy concentration does not correlate with MTRR A66G.ConclusionThe gene polymorphism of MTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G among the Hanwomen in Xiangtan was statistically different from other selected regions of China.Mutation in MTHFR C677T and A1298C were associated with elevated plasma levels of Hcy.

methylenetetrahydrofolate reductase;methionine synthase reductase;polymorphism;homocysteine

R715.5

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.015

中国疾病预防控制中心妇幼保健中心妇幼保健分子遗传医学研究专项计划（FY-ZX-ZD-0018）

1湖南省湘潭市妇幼保健院（邮编411100）；2上海靶向分子医学研究所；3中国疾病预防控制中心妇幼保健中心△

E-mail：mashaojie@genechina.com