吉西他滨联合顺铂不同给药途径对人肺癌A549细胞的抑制作用

曹 军 何 阳 刘洪强 王赛博 赵保成 郑晓辉 程英升

吉西他滨联合顺铂不同给药途径对人肺癌A549细胞的抑制作用

曹 军1，2何 阳2刘洪强2王赛博2赵保成2郑晓辉2程英升3△

目的 对比吉西他滨联合顺铂动脉化疗与静脉化疗对人肺腺癌生长的抑制作用，探索最佳给药途径。方法选取裸大鼠40只，将人源肺腺癌A549细胞系经传代培养后，移植于祼大鼠以建立肺癌模型。将荷瘤鼠均分为荷瘤对照组、假手术对照组、静脉化疗组与动脉化疗组；荷瘤对照组尾静脉注入生理盐水；动脉化疗组经动脉注入吉西他滨150 mg/kg+顺铂10 mg/kg；静脉化疗组经静脉注入吉西他滨150 mg/kg+顺铂10 mg/kg；假手术对照组经动脉注入生理盐水。观察干预前后4组大鼠肿瘤体积的变化，计算荷瘤鼠的抑瘤率，采用Western blot检测Bcl-2与半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3蛋白在肿瘤中的表达水平。结果动脉化疗组与静脉化疗组移植瘤生长均受到不同程度的抑制，动脉化疗组抑制尤为明显。动脉化疗组、静脉化疗组的瘤体质量均低于荷瘤对照组（g：1.91±0.19、2.61±0.21 vs 4.58±0.46）,差异有统计学意义,动脉化疗组、静脉化疗组的抑瘤率分别为57.6％、42.4％。经静脉与动脉给药后，Bcl-2蛋白水平均下降，Caspase-3蛋白水平均上升，以动脉给药效果更明显。结论吉西他滨联合顺铂经动脉灌注更能有效控制人肺癌细胞生长，经动脉化疗途径在肺癌治疗中更具优势。

吉西他滨；顺铂；动脉化疗；静脉化疗；肺腺癌

肺癌死亡率在我国恶性肿瘤死亡率中居第一位，其发病率仍逐年上升。肺癌分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌。NSCLC占肺癌总数的85％，其中肺腺癌占NSCLC的30％～40％[1]。大多数肺癌患者临床确诊时往往已属中晚期，丧失了手术治疗时机，因此，在肺癌的治疗方案选择中化疗仍是其主要方法。吉西他滨联合顺铂治疗肺癌的确切疗效在一些国内外研究中已得到验证[2-3]，但是关于这2种药物的不同给药途径治疗肺癌的效果却鲜有报道。本研究通过比较吉西他滨联合顺铂动脉化疗与静脉化疗对人肺腺癌生长的抑制作用，比较动脉和静脉给药途径的疗效。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌细胞株A549购自上海市肿瘤研究所。SPF级裸大鼠40只，8～10周龄，体质量（180±15）g，雌雄各半，购自上海市公共卫生临床中心实验动物部。饲养条件:各组均同等自由饮水、摄食，温度22～25℃，相对湿度40％～50％。吉西他滨(泽菲，江苏豪森药业股份有限公司)；顺铂（德州德药制药有限公司）。Bcl-2、半胱氨酸蛋白酶（Caspase)-3、GAPDH抗体均购自Santa cruz，鼠抗人二抗购自碧云天。ECL化学发光试剂盒购自BestBIO公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人肺癌A549细胞复苏，用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养，取生长良好的细胞用0.25％胰蛋白酶消化、离心，收集细胞用1 mL冰PBS稀释，浓度调整为5×106/mL，以0.2 mL接种于每只小鼠右腋皮下，待肿瘤长至体积约为10 mm×10 mm×10 mm时移植于裸大鼠耳后造模。

1.2.2 造模及分组 选择生长良好、瘤结无破溃的荷瘤裸鼠，处死后无菌条件下完整剥离瘤结，剪开瘤结，清除中心坏死组织，在用生理盐水中，用剪刀切成2 mm×2 mm×2 mm瘤组织块，将此组织块接种于裸大鼠右耳后皮下。正常饲养8 d后接种肿瘤成功，待3周后肿瘤长至2 650～2 800 mm3时，见图1，在保证各组肿瘤平均体积无明显差异的条件下，对荷瘤实验裸大鼠根据性别分层后分组：荷瘤对照组、假手术对照组、静脉化疗组和动脉化疗组，每组10只。

1.2.3 给药方法 （1）荷瘤对照组，尾静脉注入生理盐水0.5 mL。（2）动脉化疗组，荷瘤大鼠经10％水合氯醛（3.5 g/kg）腹腔注射麻醉后，沿颈部正中切开皮肤，暴露右颈动脉，见图2；于右颈动脉采用改良Seldinger技术插管，见图3；先造影证实肿瘤供血动脉，见图4；再经导管灌注吉西他滨150 mg/kg，顺铂10 mg/kg，缓慢推注，缝合皮肤。（3）静脉化疗组，吉西他滨150 mg/kg联合顺铂10 mg/kg由尾静脉注入，见图5。（4）假手术对照组，操作同动脉化疗组，经导管注入等剂量生理盐水。

1.2.4 指标测量方法 药物处理前后每天用毫米游标卡尺测量肿瘤长径及短径。计算肿瘤体积（mm3）=肿瘤长径×肿瘤短径2/2。于用药后第16天，颈椎脱臼法处死各组荷瘤裸大鼠，完整分离、取出皮下肿瘤组织，见图6，称质量，计算各组抑瘤率=（l-药物组瘤质量/荷瘤对照组瘤质量）×100％。

1.2.5 Western blot检测Bcl-2和Caspase-3表达水平 12％ SDS-PAGE分离胶电泳120 V，15 min；4％SDS-PAGE浓缩胶电泳80 V，1 h。PVDF膜半干转100 V，30 min。5％脱脂奶粉封闭过夜。一抗浓度1∶1 000孵育2 h或过夜，二抗浓度1∶5 000孵育1 h。按化学发光操作试剂盒说明,检测Bcl-2和Caspase-3表达情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。数据以±s表示，组间比较采用F检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸大鼠一般情况 40只裸大鼠完成实验时均存活，觅食、饮水、活动等一般状态良好，未发现脱毛、腹泻、明显消瘦等现象，动脉化疗组及假手术对照组手术切口均愈合良好，无一例感染。

2.2 各组荷瘤鼠肿瘤体积变化 治疗前各组移植瘤体积无明显差异（P＞0.05）。治疗后，静脉化疗组与动脉化疗组移植瘤体积均小于荷瘤对照组和假手术对照组，动脉化疗组瘤体积小于静脉化疗组（均P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of tumor volume before and after chemotherapy表1 治疗前后各组肿瘤体积比较 （n=10,mm3,±s）

Tab.1 Comparison of tumor volume before and after chemotherapy表1 治疗前后各组肿瘤体积比较 （n=10,mm3,±s）

＊P＜0.05;a与荷瘤对照组比,b与假手术对照组比,c与静脉化疗组比，P＜0.05

组别荷瘤对照组假手术对照组静脉化疗组动脉化疗组F治疗前2 786.23±120.31 2 699.46±124.18 2 663.82±125.53 2 701.08±123.26 6.67治疗4 d 3 569.84±152.81 3 452.45±153.82 2 120.32±142.26ab1 722.21±133.02abc8.24＊组别荷瘤对照组假手术对照组静脉化疗组动脉化疗组F治疗8 d 4 062.11±279.26 4 075.68±168.56 1 556.76±130.27ab1 127.62±156.03abc15.66＊治疗12 d 4 998.34±319.02 5 010.45±324.85 1 146.98±203.38ab603.75±111.42abc22.75＊治疗16 d 5 709.59±475.07 5 642.57±486.03 801.46±206.8ab325.41±81.26abc45.69＊

2.3 各组荷瘤鼠肿瘤抑制率比较 4组肿瘤的体质量（g）为动脉化疗组（1.91±0.19）、静脉化疗组（2.61± 0.21）低于荷瘤对照组（4.58±0.46）及假手术对照组（4.71±0.53），差异有统计学意义(P＜0.05)，抑瘤率分别为57.6％、42.4％。

2.4 Bcl-2和Caspase-3蛋白在不同组肿瘤中的表达水平 Bcl-2蛋白水平在静脉与动脉给药后均有下降，其中动脉给药效果更为明显，Caspase-3蛋白水平在静脉与动脉给药后均有明显上升，其中动脉给药效果更为明显，见图7。

3 讨论

吉西他滨是目前治疗NSCLC最有效的抗嘧啶代谢的化疗药物，其作用机制是在机体细胞内的核苷激酶作用下生成有活性的二磷酸核苷(dFdCDP)和三磷酸核苷(dFdCTP)，然后利用这2种代谢产物抑制DNA合成而发挥抗肿瘤作用[4]，主要作用于DNA合成期(S期)，并可阻止细胞由G1期进入S期[5]。顺铂属于细胞周期非特异性抗肿瘤药，是应用最广泛的抗癌药物之一，作用机制为可将细胞阻滞于S 期[6]，因其与其他抗癌药物无交叉耐药性，故常与其他药物联用共同治疗肿瘤。多项研究均证实吉西他滨与顺铂联用治疗NSCLC效果显著，能提高生存期、缓解全身症状及改善生活质量，疗效明显优于以往的常规化疗方案[7-10]。

在临床应用中，吉西他滨动脉灌注给药已经广泛用于肝转移瘤、胰腺癌和胆管肿瘤的介入治疗，但尚少见于肺癌的介入治疗中，且研究吉西他滨动脉用药与静脉用药的对比研究更少。A549细胞株的裸大鼠肿瘤模型是难得较大的肺癌肿瘤模型，且可重复性好，成瘤率高，便于动脉插管。本实验发现动脉化疗组中凋亡蛋白Caspase-3的表达明显高于静脉化疗组，而抗凋亡蛋白Bcl-2则低于静脉化疗组，提示动脉灌注组肿瘤细胞增殖被抑制较经静脉组更明显。表明在裸大鼠肺癌化疗药物治疗中，经动脉灌注途径具有明显优势，更能有效控制肿瘤生长。动脉化疗技术存在以下优势：（1）增加肿瘤局部药物浓度，通过导管技术选择性动脉导管化疗，可增加肿瘤内部及周边化疗药物浓度，可直接杀灭肿瘤或抑制肿瘤生长。同时，介入化疗可减少药物与血浆蛋白的结合而增加游离药物的浓度，进一步提高化疗药物对肿瘤组织的细胞毒性作用[11]。（2）减少全身不良反应，动脉化疗灌注药物可改善药物聚集，药物先经过靶区再回流到静脉系统，再到体循环，可明显减少药物对全身系统的不良反应[12-13]。

Fig.1 The construction of rat model via human A549 cell line xenograft图1 荷瘤实验裸大鼠

Fig.2 Exposure of rat carotid artery图2 暴露荷瘤实验裸大鼠右颈动脉图

Fig.3 Arterial intubation using improved Seldinger cannulation图3 采用改良Seldinger技术插管

Fig.4 Confirmation of tumor supplying arteries using radiography图4 造影证实肿瘤供血动脉

Fig.5 Intravenous chemotherapy from caudal vein图5 尾静脉注入

Fig.6 Tumor tissues图6 肿瘤组织

Fig.7 Expression of Bcl-2 and Caspase-3 in control, intravenous and arterial chemotherapy groups图7 3组肿瘤组织中Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平

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(2014-07-15收稿 2014-08-09修回)

（本文编辑 闫娟）

Inhibiting Effect of Different Administration Route of Gemcitabine Combined with Cisplatin on A549 Cell Lines

CAO Jun1,2,HE Yang2,LIU Hongqiang2,WANG Saibo2,ZHAO Baocheng2,ZHENG Xiaohui2,CHENG Yingsheng3△
1 Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;2Dahua Hospital,Xuhui District,Shanghai; 3 Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’s Hospital
△

E-mail:chengyingsheng@hotmail.com

ObjectiveTo compare the inhibiting effect on human lung adenocarcinoma who were treated with gemcitabine combined with cisplatin chemotherapy through either arterial or intravenous route to explore the optimum administration route.MethodsHuman lung adenocarcinoma derived A549 cells were transplanted into 40 BALB/c-nu mice to establish lung cancer model.The models were divided into 4 groups:animals in arterial or intravenous chemotherapy groups were treated with gemcitabine 150 mg/kg combined with cisplatin 10 mg/kg through either arterial route or intravenous route.Animals in negative control group were given normal saline through caudal vein while animals in sham operation group were treated with normal saline via arterial route.Then dynamical change of tumor volume and tumor inhibiting rate were assessed,and Bcl-2 and Caspase 3 expressions were investigated using western blot.Finally inhibiting effect were compared between these two different administration routes.ResultsTransplanted tumors in arterial and intravenous chemotherapy groups(especially in arterial group)were suppressed,in terms of mass of tumor（g:1.91±0.19,2.61±0.21 vs 4.58± 0.46）,compared to the control group(P＜0.05).Furthermore,tumor inhibiting rates in arterial chemotherapy group and venous chemotherapy group are 57.6％and 42.4％respectively(P＜0.05).Expression of Bcl-2 was down regulated while expression of Caspase-3 was up regulated upon both arterial and intravenous chemotherapy.And arterial route showed much more obvious tumor apoptosis effect than venous route.ConclusionArterial route of gemcitabine combined with cisplatin for lung adenocarcinoma treatment is more effective to restrain the tumor growth in clinical application.

gemcitabine；cisplatin；arterial chemotherapy；intravenous chemotherapy;lung neoplasm

R734.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.008

上海市自然科学基金（12ZR1428900）;上海市卫生局青年科研项目（20124Y096）

1苏州大学医学部（邮编215123）；2上海市徐汇区大华医院；3上海交通大学附属第六人民医院

△通讯作者 E-mail：chengyingsheng@hotmail.com