顺铂对结直肠癌细胞增殖及侵袭能力的影响

徐阳

顺铂对结直肠癌细胞增殖及侵袭能力的影响

徐阳

目的探讨顺铂对人结直肠癌细胞SW480增殖及侵袭力的影响。方法以SW480细胞为研究对象，设定未经处理的SW480细胞为对照组，给予不同浓度顺铂进行不同时间干预，应用MTT法、Transwell侵袭小室、定磷法检测SW480细胞的增殖、侵袭力及Na+-K+-ATP酶活性。结果生理浓度顺铂（70 μmol/L）在48 h即可抑制SW480细胞的增殖，与72和96 h相比抑制率差异无统计学意义；70 μmol/L顺铂处理48 h时，即可降低穿越Matrigel膜基质的细胞数；分别采用17.5、35、70和140µmol/L4个梯度浓度的顺铂作用于SW480细胞48 h后，35、70和140µmol/L组细胞中Na+-K+-ATP酶活性均显著升高，且顺铂浓度达70µmol/L时Na+-K+-ATP酶即可达到较高活性。结论Na+-K+-ATP酶活性的降低可能导致对结直肠癌细胞增殖和侵袭能力调节作用减弱，可能与结直肠癌细胞SW480耐顺铂有关。

结直肠肿瘤；顺铂；细胞增殖；肿瘤侵润；抗药性,肿瘤；SW480；Na+-K+-ATP酶

结直肠癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，且发病率有逐年上升趋势[1]。肿瘤的转移是一个涉及多因素和多步骤调控的过程，而通过侵袭穿过基底膜则是转移发生的开始[2]。据报道，结直肠癌病死数约占2012年美国癌症总死亡数的9％[3]。顺铂是目前治疗实体瘤的一线药物，临床应用广泛，然而其耐药性成为应用的瓶颈[4]。研究发现肿瘤细胞胞内顺铂蓄积的减少是其对顺铂产生耐药性的机制之一，而结直肠癌常伴有Na+-K+-ATP酶活性下降及其亚单位异常表达[5]，但其是否和顺铂耐药有关尚不明确。本研究旨在探讨顺铂对SW480细胞增殖和侵袭作用的影响及Na+-K+-ATP酶活性和表达的差异。

1 材料与方法

1.1 实验材料人结直肠癌细胞SW480购自中国科学院上海细胞库，DMEM培养基及胎牛血清（FBS）购自美国GIBCO公司；噻唑蓝（MTT）购自美国AMRESCO公司；Transwell小室（8 μm）购自美国Millipore公司；Matrigel购自美国BD公司；Na+-K+-ATP酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1MTT法检测细胞的增殖将SW480细胞均按3×103/孔，接种于96孔细胞培养板，待细胞的融合度为70％～80％时，分别加入含70 μmol/L顺铂的培养基孵育24、48、72及96 h，每时点重复6孔；同时设不加顺铂的对照组，各组每孔加入5 g/L MTT 20 μL，继续孵育4 h，弃掉培养基，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），震荡10 min，酶标仪上检测570 nm的光密度（OD）值，并计算抑制率。抑制率=（对照组OD值－处理组OD值）/对照组OD值×100％。以上试验重复3次并取平均值。

1.2.2 细胞侵袭能力的检测取100 μL稀释液加入Transwell上室中，并在小室底部均匀涂抹一层稀释的Matrigel膜基质，放入细胞培养箱中30 min，将Transwell小室倒置。取100 μL细胞悬液加在底面上，放入细胞培养箱中12 h，然后将Transwell小室放入24孔培养板中，上室加入培养基，下室加入牛血清白蛋白（BSA）培养基，再放入细胞培养箱中继续培养72 h。试验设浓度分别为17.5、35、70、140µmol/L的顺铂处理SW480细胞48 h，同时设不加顺铂的对照组。于下室中的BSA培养基中加入含有以上不同浓度的顺铂500 μL。取出Transwell小室，弃去培养液，用棉签擦拭小室底面除去未穿过细胞，用PBS浸洗2次，每个Transwell上室均加入Wright-Giemsa A液放置10 min后，再加入Wright-Giemsa B液染色10 min，用MiliQ水除去染料。在倒置显微镜下随机读取5个视野，计算每视野内的细胞数，实验重复3次取平均值。

1.2.3Na+-K+-ATP酶活性测定在细胞培养瓶中接种细胞，分别加入17.5、35、70、140µmol/L的顺铂培养48 h，收集细胞，超声破碎，测定蛋白总量。采用定磷法测定Na+-K+-ATP酶活性，其测定原理为ATP酶可以分解ATP生成ADP和无机磷，而根据测定反应后1 h无机磷[µmol（/h·mg）]的量即可判断出Na+-K+-ATP酶活力的高低。实验操作严格按试剂盒说明操作。

1.3 统计学方法实验数据用SPSS 18.0统计软件进行分析。结果以均数±标准差（±s）形式表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 顺铂对SW480细胞增殖活力的影响生理浓度的顺铂（70µmol/L）在24、48、72和96 h时间均能显著抑制SW480细胞的增殖，48 h时即可达到较高的抑制细胞增殖活力，且抑制效果不随作用时间的延长而增加，见表1。

Tab.1 Effects of Cisplatin on the proliferation of SW480 cells at different time points表1 不同时间顺铂对SW480细胞增殖抑制率的影响（％，±s）

Tab.1 Effects of Cisplatin on the proliferation of SW480 cells at different time points表1 不同时间顺铂对SW480细胞增殖抑制率的影响（％，±s）

＊P＜0.05；a与（1）组比较，P＜0.05

组别70µmol/L 24 h组（1）70µmol/L 48 h组（2）70µmol/L 72 h组（3）70µmol/L 96 h组（4）F n3333抑制率33.65±2.85 42.85±3.27a35.28±3.78 37.63±4.25 5.553＊

2.2 顺铂对SW480细胞侵袭力的影响70和140 µmol/L顺铂作用SW480细胞48 h，穿越Matrigel膜基质的细胞数较17.5和35µmol/L组下降，表明低浓度顺铂对SW480的侵袭能力影响不大，而高浓度能够降低SW480细胞的侵袭能力，见表2。

Tab.2 Effects of different concentrations of Cisplatin on migrating of SW480 cells表2 不同浓度顺铂对SW480细胞侵袭力的影响（±s）

Tab.2 Effects of different concentrations of Cisplatin on migrating of SW480 cells表2 不同浓度顺铂对SW480细胞侵袭力的影响（±s）

＊P＜0.05；a与（1）组比，b与（2）组比，c与（3）组比较，P＜0.05

组别对照组（1）17.5µmol/L48 h组（2）35µmol/L48 h组（3）70µmol/L48 h组（4）140µmol/L48 h组（5）F n66666细胞数48.16±4.58 40.64±4.37a36.23±3.67a27.18±3.30abc24.62±3.04abc4.456＊

2.3Na+-K+-ATP酶活性检测17.5～140µmol/L 4个梯度浓度的顺铂作用于SW480细胞48 h后，35、 70和140µmol/L组细胞中Na+-K+-ATP酶活性均显著升高，且顺铂浓度达70µmol/L时Na+-K+-ATP酶即可达到较高活性，见表3。

Tab.3 Effects of different concentrations of Cisplatin on Na+-K+-ATPase activity of SW480 cells表3 不同浓度的顺铂对SW480细胞中Na+-K+-ATP酶活性的影响[µmol（/h·mg），±s]

Tab.3 Effects of different concentrations of Cisplatin on Na+-K+-ATPase activity of SW480 cells表3 不同浓度的顺铂对SW480细胞中Na+-K+-ATP酶活性的影响[µmol（/h·mg），±s]

＊P＜0.05；a与（1）组比，b与（2）组比，c与（3）组比较，P＜0.05

组别对照组（1）17.5µmol/L48 h组（2）35µmol/L48 h组（3）70µmol/L48 h组（4）140µmol/L48 h组（5）F n33333 Na+-K+-ATP酶活性8.38±0.41 9.36±0.62 10.27±0.54a11.35±0.48abc11.76±0.43abc5.553＊

3 讨论

3.1Na+-K+-ATP酶与顺铂的作用机制如何减少顺铂耐药的发生，增强化疗药物的敏感性是医学研究的重点领域[6]。细胞膜上Na+-K+-ATP酶是由多种功能相关的多肽链所组成的蛋白多聚体，可催化Na+、K+跨膜转运，在哺乳动物均有发现。Na+-K+-ATP酶参与细胞的多种基本生理活动，研究证实Na+-K+-ATP酶首先产生电化学梯度，然后调节顺铂进入多种细胞[7-8]。有学者发现在顺铂作为人舌癌细胞（HSC-3）、人口腔鳞癌细胞（BHY）中Na+-K+-ATP酶特异性抑制剂，可以显著减少其在细胞内的蓄积，并且耐顺铂细胞系BHY细胞的Na+-K+-ATP酶活性显著低于顺铂敏感系HSC-3细胞，证明顺铂在细胞内的蓄积可能与Na+-K+-ATP酶及其活性有关[9]。目前的研究发现Na+-K+-ATP酶有许多亚基，其中α亚基主要起催化作用，是其主要功能亚基和活性中心；β亚基主要起调节作用，对维持Na+-K+-ATP酶活性起着重要作用[10]。近年研究表明，Na+-K+-ATP酶活性的改变和基因的异常表达与肿瘤的发生发展有着十分密切的联系，α和β亚基的表达水平对预测某些肿瘤的预后有着重要意义[11]。

3.2Na+-K+-ATP酶活性与顺铂的关系本研究表明生理浓度的顺铂（70 μmol/L）在24、48、72和96 h时均能显著抑制SW480细胞的增殖，48 h时抑制率最高；低浓度顺铂对SW480的侵袭能力影响不大，而高浓度能够降低SW480细胞的侵袭能力。已有实验证明Na+-K+-ATP酶α1、β1亚基和顺铂进入肿瘤细胞内的过程有关，并且这两种亚基的高表达和顺铂敏感性有关[12]。推测顺铂可能通过影响其某一亚基的表达而影响酶的活性，进而影响了顺铂进入细胞内这一过程，从而表现出顺铂敏感性的变化。这有待进一步采用RT-PCR方法研究证实。

综上所述，Na+-K+-ATP酶活性的降低可能导致对结直肠癌细胞增殖和侵袭能力调节作用减弱，可能与结直肠癌细胞SW480耐顺铂有关，检测其活性对结直肠癌的诊断和预后具有重要价值。

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（2013-10-30收稿2014-03-20修回）

（本文编辑李鹏）

Effects of Cisplatin on Proliferation and Invasion of Colorectal Cancer Cells

XU Yang
Department of Colorectal Surgery,The Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

ObjectiveTo investigate the effect of cisplatin on proliferation and invasion of colorectal cancer cell line SW480.MethodsSW480 cells were used as the research object,and untreated SW480 cells were used as the control group.Different concentrations of cisplatin was given at different times to intervene.The MTT,Transwell chamber and phosphate determination methods were used to detect proliferation,invasion and Na+-K+-ATPase activity expression level in SW480 cells.ResultsThe physiological concentration of cisplatin(70µmol/L)inhibited the proliferation of SW480 cells at 48 h.There was no significant difference in the inhibition rate at 48 h compared with 72 h and 96 h.Treatment with 70 µmol/L cisplatin for 48 h reduced the number of cells through Matrigel membrane matrix.The Na+-K+-ATPase activity was significantly increased in 35,70 and 140µmol/L cells after treatment with 17.5,35,70 and 140µmol/L of cisplatin in SW480 cells for 48 h,and Na+-K+-ATPase reached the highest level at 70µmol/L of cisplatin.ConclusionThe decreased activity of Na+-K+-ATPase may lead to the attenuation in proliferation and invasion of colorectal cancer cells,which may be associated with cisplatin resistance in colorectal cancer cell SW480.

colorectal neoplasms；cisplatin；cell proliferation；neoplasm invasiveness；drug resistance,neoplasm；SW480；Na+-K+-ATPase

R349.5，R735.34

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.004

天津医科大学第二医院肛肠外科（邮编300211）