亚甲基蓝测定微量肝素钠的研究

亓培培

（淮北市环保局 环境检测站，安徽 淮北 235000）

肝素（Hep）为葡糖胺聚糖，是蛋白多糖的一种.在人体内由肥大细胞分泌而自然存在于血液中，在体内外均有延缓或阻止血液凝固的作用［1］.作为经典的抗凝血药物，肝素在临床上的应用已达60年之久，目前仍是心血管和血栓病人的首选抗凝血药［2］.

肝素是由葡萄糖胺磺酸、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸组成的，具有不同链长的多糖链混合物.在水溶液中由于其酸性基团的离解而成为带多个负电荷的大阴离子.肝素的检测方法有多种，总的分属于生物方法［3］和化学方法两大类.生物方法是法定方法，因受生物个体的影响较大，不易掌握.化学方法有分光光度法［4-8］、HPLC法［9］、毛细管电泳法［10］、电化学传感器［11］等.其中分光光度法因具有操作简便、快速、仪器价廉、灵敏度较高的优点而得到广泛的应用.因此进一步研究灵敏度高、选择性好的新分光光度法有重要的意义.实验结果发现，在pH为1.4～5.8的缓冲溶液中肝素钠能与亚甲基蓝发生缔合，使溶液出现明显的褪色，溶液吸光度的减少与肝素钠浓度成正比，建立了测定肝素钠浓度的分光光度法.该方法稳定性好，而且反应的pH值范围宽.用于注射用肝素钠浓度的测定结果满意.

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

TU－1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；pHs-3型酸度计（上海第二分析仪器厂）.

肝素钠标准溶液：准确称取1.000 g肝素钠固体（中国医药集团上海化学试剂公司），用去离子水溶解稀释，定容于1 000 mL容量瓶中，其质量浓度为1.00 mg/ mL，备用.再准确量取5.00 mL 上述标准溶液，用去离子水稀释，定容于1 000 mL 容量瓶中，制得5.00 mg/L 的标准溶液.亚甲基蓝溶液：浓度为5.0×10-4mol/L作为储备液，再稀释成2.0×10-5mol/L使用.

乙酸-乙酸钠缓冲溶液：准确称取2.736 g乙酸钠，量取3 mL 36.5%的乙酸溶液用去离子水稀释定容于100 mL容量瓶中，备用.根据体积比配成pH 4.6的缓冲溶液或用酸度计调制成pH 4.6的缓冲溶液.

上述所需试剂均为分析纯或优级纯，配制溶液用去离子水.

1.2 实验方法

在25 mL的比色管中依次加入pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液2.0 mL，亚甲基蓝溶液1.0 mL和肝素钠标准溶液10.0 mL，稀释至刻度，摇匀，放置10 min 后，以水为参比，测定664 nm 处样品溶液吸光度A；同时做试剂空白，吸光度值为A0，并计算吸光度差值ΔA=A0-A.

2 结果和讨论

2.1 吸收光谱

分别对未加肝素钠的1.0 mL 亚甲基蓝标准溶液和加入20 μg、40 μg、60 μg、80 μg 肝素钠的亚甲基蓝标准溶液在200～800 nm的波长范围内进行扫描所得的吸收光谱如图1所示.亚甲基蓝溶液在664 nm处的吸收峰出现最大值，加入肝素钠后，肝素钠与亚甲基蓝作用使溶液褪色，不加肝素钠和加入肝素钠所测得的吸光度之差ΔA在一定范围内与肝素钠含量呈线性关系.

图1 吸收光谱（1-5肝钠素浓度）

2.2 缓冲溶液pH对体系的影响

按实验方法改变缓冲溶液的pH 进行实验，结果见表1.由表1可知，在缓冲溶液的pH维持在4.6时肝素钠和亚甲基蓝的吸收强度下降显著，所以本实验选用pH为4.6的缓冲溶液.

表1 缓冲溶液pH对体系的影响

2.3 缓冲溶液用量对体系的影响

按实验方法改变缓冲溶液的用量进行实验，结果如图2所示.由图2可知，在缓冲溶液用量为2.0 mL时肝素钠和亚甲基蓝的吸收强度下降显著，所以本实验选用pH值为4.6的缓冲溶液最佳用量为2.0 mL.

图2 缓冲溶液的用量/（V/mL）

图3 亚甲基蓝的用量/（V/mL）

2.4 亚甲基兰用量对体系的影响

按实验方法改变亚甲基蓝的用量进行实验，结果如图3.由图3可知，在2×10-5mol/L亚甲基蓝用量为0.80 mL时的吸收强度下降最大，因此亚甲基蓝最佳用量可以选择为0.80 mL.

2.5 试剂加入顺序的影响

实验过程中，考察了3 种试剂加入顺序对体系的影响.实验结果表明，试剂加入顺序对体系没有影响.

2.6 反应时间的影响

在最佳实验条件下反应时间的影响结果如图4所示.由图4可知，亚甲基蓝与肝素钠反应瞬间完成，且吸收强度在1 h内保持稳定；而空白溶液吸收强度基本保持稳定不变，5 min以后吸收强度逐渐减小，但减小程度变化缓慢，对实验产生的影响不大，选择放置5 min.

2.7 干扰实验

对多种可能共存物的干扰进行了实验.实验可知，当DNA的浓度大于11 μg/ mL时对肝素钠的测定产生干扰.RNA对肝素钠产生干扰的最大浓度为5 μg/ mL.

2.8 工作曲线

按照实验步骤在最佳条件下测吸光度绘制工作曲线（见图5），由图5可知，0～1.6 mg/L范围内有良好的线性关系.线性方程：ΔA=0.191 2c-0.002 9，相关系数r=0.996 4.检出限是 10 μg/25 mL，对于0.8 mg/L的肝素钠5次测定的相对标准偏差为0.8%，说明本法准确可行.尽管本法灵敏度不是太高，但有使用仪器较简单、药品易得且廉价，实验方法简便、快速、选择性较好等优点.

图4 时间扫描图

图5 标准曲线

2.9 合成样品的分析

配制了3个合成试样进行测定，结果见表2.

表2 合成样品的分析

［1］周自永.新编常用药手册［M］.北京：金盾出版社，1987.

［2］姬胜利，张天民.肝素与低分子肝素的研究进展［J］.中国生化药物杂志，1996，17（5）：216-218.

［3］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典（第二部）［M］.北京：化学工业出版社，1995：307.

［4］BAND P，LUKTON A.The specific assey of heparin by its chemical properties［J］.Anal Biochem，1982，120（1）：19-21.

［5］王云志，黄喜茹，侯海妮，等.用次甲基蓝测定肝素钠注射液的效价［J］.河北医学院学报，1992，13（2）：65-67.

［6］JIAO Q C，LIU Q，SUN C，et al.Investigation on the binging site in heparin by spectrophometry［J］.Talanta，1999，48：1095-1101.

［7］JIAO Q C，LIU Q.Mechanism of interference and a zura response in the heparinassay［J］.Analytical Letters，1998，31（8）：1311-1323.

［8］NMCOVA I，RYCHLOVSKY P，HAVELCOVA M，et al.Determination of heparin using flow injection analysis with spectro⁃phometric detection［J］.Anal Chm Acta，1999，401：223-228.

［9］毛平，黄晓兰，李翠贞，等.高效液相色谱法测定血浆肝素含量［J］.中华医学检验杂志，1995，18（6）：358-360.

［10］AMDOFO S A，WANG H M，LINHARDT R J.Disaccharide compositional analysis of heparin sulfate using capillary zone electrophoresis［J］.Anal Biochem，1991，199（2）：249-255.

［11］MA S H，YANG V C，MEYERHOFF M E.Heparin responsive electrochemical sensor：A preliminary study［J］.Anal Chem，1992，64（6）：694-697.