木姜子枝叶中化学成分活性的研究

杨秀芳， 王 媛， 马养民， 贾强强， 刘建军, 康永祥

(1.陕西科技大学 化学与化工学院 教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室, 陕西 西安 710021； 2.西北农林科技大学 林学院， 陕西 杨凌 712100)

0 引言

木姜子(Litseapungens)属植物隶属于樟科木姜子族，为常绿或落叶乔木或灌木，种类多且分布广，全世界约有200余种.主要分布在亚洲热带，亚热带以及美洲[1].我国独有72种，以南方及西南温带地区[2]为主.木姜子是我国传统的中草药，其果、叶、根都可入药[3].目前研究结果表明，木姜子属植物含有丰富的化学成分，以甾体[4]、生物碱[5]、黄酮[6]、内酯[7，8]、木质素[9]等为主.活性研究显示，该属植物具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、治疗心血管疾病[10]、抑制血小板凝聚[11]等功效.为阐明木姜子药理活性与其化学成分的构效关系，本文在对木姜子化学成分研究的基础上，首次对分离得到的单体化合物进行了体外抑菌活性、抗氧化活性研究，为该药物的研发提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 试药

1.1.1 样品

秦岭太白山木姜子枝叶中分离纯化得到了9个单体化合物，分别为棕榈酸、芹菜素、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮素、β-谷甾醇、山萘苷、松属素pinocembrin、松属素查儿酮、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷[12].

1.1.2 供试菌种

真菌4株：西瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.niveum)、苹果腐烂病菌(V.mali)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、芍药炭疽病(C.gloeosporioides).

细菌6株:乳链球菌(Streptococcuslactis) 、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Esherichiacoli)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)、枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilis).

1.1.3 培养基

(1)PDA培养基：马铃薯(去皮)200.0 g，葡萄糖7.5 g，KCl 0.125 g，NaNO35 g，K2HPO40.25 g，琼脂18 .0 g ，FeSO40.002 5 g，MgSO4·H2O 0.125 g，蒸馏水1 000 mL.

(2)NA培养基：琼脂1.5～2.0 g，蛋白胨1.0 g，牛肉膏0.5 g，KCl 0.5 g，去离子水100 mL，pH7.0～7.2,121 ℃灭菌20 min.

1.2 主要仪器设备

SW-CJ-1FD超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DH5000AB型电热恒温培养箱，天津泰斯特有限公司；XFLH-50CA电热式压力蒸汽灭菌器，浙江新丰医疗器械有限公司； 723N可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；96孔板，上海科兴生物科技有限公司.

1.3 生化试剂

牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、琼脂，北京奥博星生物技术有限责任公司；1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；抗坏血酸，天津市百世化工有限公司.

1.4 实验方法

1.4.1 菌悬液的配置

从试管斜面上刮取少量的绿脓杆菌(P.a)、枯草芽孢杆菌(B.s)大肠杆菌(E.c)金黄色葡萄球菌(S.a)、乳链球菌 (S.l)、纳豆芽孢杆菌 (B.n)、西瓜枯萎病菌(F.of.sp.n)、苹果腐烂病菌(V.m)、番茄灰霉病菌 (B.c)、芍药炭疽病菌(C.g)，将其接种到液体培养基中制成菌悬液.将配制好的菌悬液，转移至恒温振荡器，在28 ℃培养48 h，用血细胞计数板将其浓度调至1×104～2×105cfu /mL，备用.

1.4.2 样品溶液配置

将从木姜子枝叶中分离得到的9个单体化合物分别精密称取.

(1)用二甲基亚砜溶解，配制成浓度为800μg·mL-1的溶液.

(2)用甲醇溶解，配制成2 000μg·mL-1的甲醇溶液.同时,配制浓度为0.1μg·mL-1的DPPH甲醇溶液置于冰箱中备用.

1.4.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定

采用96孔板法，按照参考文献[13]最小抑菌浓度(MIC)测定方法中的(1)～(3)操作.经过倍半稀释后，所有板孔中化合物被稀释成系列浓度，其浓度大小依次为400μg·mL-1、200μg·mL-1、100μg·mL-1、50μg·mL-1、25μg·mL-1、12.5μg·mL-1、6.25μg·mL-1、3.13μg·mL-1、1.56μg·mL-1、0.78μg·mL-1.其中细菌以青霉素钠作为阳性对照，真菌以酮康唑作为阳性对照.

向所有板孔中加入10μL的一种菌悬液.另取96孔板重复前面的操作，直至将所有的测试菌加完.把准备好的96孔板放入恒温培养箱中，28 ℃下，细菌培养24 h，真菌培养48 h，用酶标仪在波长为595 nm处测定各个板孔的透光率.重复3～5次，以平均结果计.再由透光率计算各个样品的抑制率[14].

式中：P为抑制率，K0为溶剂对照孔透光率，K1为样品孔透光率，K2为空白对照孔透光率.

1.4.4 抗氧化活性测定(DPPH法)

参照文献[15]，对96孔板编号，方法与1.4.3中(1)基本相同，按编号采用倍半稀释法向各孔中分别注入100μL的松属素pinocembrin、松属素查儿酮、山萘苷、芹菜素、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮素、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷的2 000μg·mL-1的甲醇溶液，再用移液枪依次注入0.1μg·mL-1100μL DPPH甲醇溶液混合，于室温下遮光放置30 min，在517 nm波长，测定每个样品孔的吸光度(Ai)；以100μL甲醇和100μL浓度为0.1μg·mL-1DPPH溶液混合液代替样品为空白,吸光度记为A0；100μL甲醇和100μL 对应样品浓度的甲醇混合液为样品底物吸收校正液,吸光度记为A1.重复测定3～5 次，以样品浓度为横坐标，DPPH自由基清除率为纵坐标作图，并进行回归分析，计算样品清除率为50%时样品的浓度值(IC50).清除率计算公式为：

2 结果与讨论

2.1 化合物的抗菌活性

从木姜子分离得到的化合物棕榈酸(Ⅰ)、β-谷甾醇(Ⅱ)、松属素(pinocembrin)(Ⅲ)、松属素查儿酮(Ⅳ)、山萘苷(Ⅴ)、芹菜素(Ⅵ)、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅶ)、异槲皮素(Ⅷ)、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅸ)的MIC测试结果见表1.其中有8个化合物对测试的10种菌显示出不同程度的抑制生长作用.其中黄酮类化合物Ⅲ-Ⅸ对多种测试菌有抑制作用，MIC大多数不超过50μg·mL-1；松属素查儿酮对细菌抑制效果大于真菌，尤其是对枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌的MIC达到12.5μg·mL-1；化合物Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ对植物病原真菌的抑制生长活性大于细菌，MIC均小于50μg·mL-1,其中对苹果腐烂病菌、芍药炭疽病菌的MIC为12.5μg·mL-1；但化合物棕榈酸对10种测试菌均未表现出明显的抑制作用.以上分析结果表明，木姜子属植物中抑菌活性比较好的化合物为黄酮类化合物.

表1 不同化合物对细菌最小抑菌浓度(MIC)

注：表中CK1、CK2为对照，其中CK1为青霉素钠，CK2为酮康唑.

表2 化合物的抗氧化活性结果

2.2 化合物的抗氧化活性

抗氧化活性数据IC50显示(如表2):测试样品化合物的抗氧化作用不同,均不及Vc(抗坏血酸).但具有清除DPPH自由基的能力,说明木姜子中黄酮类化合物具有广谱抗氧化作用，活性由高到低顺序为：异槲皮素>芹菜素>木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷>芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷>山萘苷>松属素查儿酮>松属素Pinocembrin.由实验结果再结合化合物的结构，发现黄酮类化合物抗氧化作用的构效关系如下.

(1)黄酮骨架结构中B环对其抗氧化活性影响较大，而B环上的4′-OH表现出强的优势.这可能是由于B环上的4′-OH有利于增长黄酮分子结构中的共轭链，形成相对稳定的中间体；其次，黄酮类化合物抗氧化性的强弱还与B环上的酚羟基数目有关.如：异槲皮素的抗氧化活性>芹菜素，木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷抗氧化作用>芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷.表现在这些化合物的IC50值比B环没有羟基的松属素查儿酮和松属素Pinocembrin的IC50值低.

(2)C环的C-2和C-3之间的双键对其抗氧化活性也有影响.如：化合物Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ的抗氧化活性都高于松属素Pinocembrin.分析原因可能是C-2和C-3双键加氢后，共轭体系缩短，使黄酮骨架上羟基的作用降低，导致黄酮的抗氧化活性也有所减弱.

(3)黄酮结构中的酚羟基成苷对抗氧化活性也有影响.如：芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷的IC50值比芹菜素的IC50值高3倍；也就是说7-位酚羟基氧成糖苷后，使其抗氧化活性降低，原因可能是空间位阻效应，导致黄酮骨架上羟基抗氧化能力有所下降.

3 结论

(1)抗菌实验结果显示，木姜子主要活性成分为黄酮类化合物，这些化合物对微生物有很好的抑制作用，可以作为抑菌剂进一步开发利用.

(2)抗氧化数据表明，木姜子中黄酮类化合物具有广谱抗氧化性，其中异槲皮素抗氧化活性比较好，这为天然抗氧化剂植物原料开发利用提供了途径.

通过对木姜子中多种化合物的生物活性研究表明，木姜子有多种活性成分，应该加大秦巴山区这一重要资源的开发利用，为该地区的经济发展注入新的活力.

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