品系、性别和生物节律对小鼠旷场实验的影响

刘友平，刘 田，毕 航，张 磊，党永辉

(1.西安交通大学宗濂书院，2.西安交通大学启德书院，3.西安交通大学医学部法医学院，陕西西安 710061)

品系、性别和生物节律对小鼠旷场实验的影响

刘友平1，刘 田2，毕 航2，张 磊1，党永辉3

(1.西安交通大学宗濂书院，2.西安交通大学启德书院，3.西安交通大学医学部法医学院，陕西西安 710061)

目的探讨性别、品系以及昼夜生物节律对旷场实验的影响。方法利用旷场实验检测不同性别的C57BL/6、BALB/c、昆明小鼠在白天与夜间对新环境的探索行为与自发活动能力。结果3种品系小鼠旷场实验结果显示：C57BL/6在旷场中探索活动和自发活动量最低，显著低于BALB/c和昆明小鼠；C57BL/6雌、雄小鼠在白天和夜晚探索活动和自发活动量未见差异，而BALB/c和昆明小鼠分别在白天和夜间呈现性别差异；C57BL/6雌雄小鼠昼夜探索活动和自发活动量差异均无统计学意义，而BALB/c和昆明雌性小鼠呈现夜间高于白天，雄性小鼠则无此表现。结论C57BL/6小鼠在新环境中探索活动少，自发活动量低，且受性别、节律因素影响较小，适合用于神经行为学和焦虑相关行为研究。

旷场实验；探索行为；自发活动；品系；性别；生物节律；神经行为学；BALB/c小鼠；C57BL/6小鼠；昆明小鼠

小鼠(Mus musculus)是广泛应用于生命科学、神经科学、生理心理学和神经精神药物学等研究领域的实验动物之一［1］，根据其基因纯合程度常可分为近交系(inbred strain)和封闭群(closed colony)两类［2］。按照我国《实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制》标准，近交系小鼠是指连续20代以上的全同胞兄妹或亲子交配培育而成，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先的遗传群；封闭群小鼠则是指以非近亲交配方式进行繁殖生产的一个实验动物种群，在不从外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4代以上的群体［2-3］。近交系常见品系有C57BL/6、BALB/c等，封闭群常见有昆明、ICR等品系小鼠［2］。

旷场实验(open field test，OFT)，也称敞箱实验、空场实验，是评价啮齿类实验动物运动功能［4］和焦虑状态［5］的经典行为学方法，被广泛运用于精神神经药理学、神经行为学等的基础研究［5-6］。其原理基于啮齿类动物同时有畏惧空旷场地和探究新事物、新环境的天性［7］，因此在一个开阔的场地中其活动呈现趋避性(phobotaxis)［8］。一般认为在实验动物没有事先熟悉敞箱的情况下，记录到的旷场活动前10～20 min以探究活动为主，后30～40 min主要反映自发活动［9］。旷场实验受到诸多因素的影响，诸如动物遗传变异［10］、性别、实验环境［11］、昼夜节律、动情周期等［12］。

为研究旷场实验主要指标所受实验条件的影响，本文通过研究不同性别、不同品系(昆明、C57BL/6和BALB/c)小鼠在不同测试时间(早、晚)旷场活动中的表现，深入探讨品系、性别和生物节律对小鼠旷场实验的影响。

1 材料与方法

1.1 动物昆明、C57BL/6、BALB/c小鼠各32只，雌雄各半，购自西安交通大学医学院实验动物中心，实验已获西安交通大学实验动物管理委员会批准，并按动物实验管理条例进行小鼠饲养和管理。同品系同性别小鼠每4只随机同笼饲养。小鼠按性别、品系分别进行随机分组，每8只分为1组，以K、C、B分别代表昆明、C57BL/6、BALB/c各品系，F、M代表雌、雄，D、N代表白天、夜间，共分为KFD、KFN、KMD、KMN、CFD、CFN、CMD、CMN、BFD、BFN、BMD、BMN共12组(n=8)，各组间小鼠体质量经统计学检验未见差异。饲养条件：室温(23±1)℃；湿度(50 ±5)%；日光灯采光，光暗周期12/12(光照时间为7∶00～19∶00)；动物自由获取水和食物。

1.2 仪器设置采用计算机实时监测分析系统SMART VIDEO-TRACKING(美国、SMARTv3.0.02)。该仪器主要由4个40 cm×40 cm×40 cm实验敞箱组成，箱子顶部中央安置有与记录系统相连接的摄像机，通过系统分析小鼠实时图像以获得小鼠在旷场中的行为数据。

1.3 OFT实验实验前将各品系小鼠在饲养室适应1周，在此期间每天抓摸动物5 min左右使其适应实验者的操作。实验开始前30 min将小鼠移入测试室适应，以保证实验时小鼠活动趋于稳定。测试时间：白天为8∶30～11∶30，夜间为20∶30～23∶30。实验前选择SMART系统中的旷场模式并进行模式指标设定，将记录时间设置为1 h，调节亮度等参数，将小鼠背对操作者放入旷场中央，键入“开始”命令后开始进行实验记录。每只动物实验结束后清除敞箱底板粪便，用500 m L/L乙醇喷洒敞箱底部并用洁净纱布抹干，以避免前次实验动物的残留气味影响本次实验。

实验结束获得实验轨迹数据后，利用SMART系统对数据进行分析，获得1 h内的每10 min路程距离、总路程距离、前10 min进入中央区域次数等数据。以前10 min实验反映小鼠对新环境的探索活动，后40 min反映小鼠自发活动。

1.4 统计学分析所有数据应用SPSS 18.0软件包进行处理和分析，各组结果比较采用单因素方差分析并进一步做两两比较(LSD法)，分析品系、性别、节律对旷场实验结果指标的影响采用三因素析因实验方差分析。数据均以表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 品系因素对小鼠旷场实验的影响3种品系雌性小鼠前10 min探索活动中，白天的测试结果未见明显差异，而夜间则显示差异有统计学意义：C57BL/ 6、BALB/c、KM探索活动依次递增(P(CFN；BFN)= 0.018，P(CFN；KFN)＜0.001，P(BFN；KFN)=0.001)；雄性小鼠则不论白天夜间，BALB/c、KM都显著高于C57BL/6小鼠(P(CMD；BMD)=0.001，P(CMD；KMD)= 0.006；P(CMN；BMN)=0.026，P(CMN；KMN)=0.041，图1A)。

3种品系雌性小鼠后40 min自发活动的测试结果：在白天，尽管C57BL/6、BALB/c之间差异无统计学意义，但3者在数值上呈递增趋势(其中P(CFD；KFD)=0.006)；在夜间，C57BL/6、BALB/c、KM之间差异有统计学意义，依次递增(P(CFN；BFN)=0.001，P(CFN；KFN)＜0.001，P(BFN；KFN)=0.001)。3种品系雄性小鼠在白天BALB/c、KM结果高于C57BL/6，差异有统计学意义(P(CMD；BMD)＜0.001，P(CMD；KMD)= 0.001)，在夜间BALB/c活动量依然最高，C57BL/6、KM间差异无统计学意义(P(CMN；BMN)＜0.001，P(BMN；KMN)=0.011，图1B)。

2.2 性别因素对3种品系小鼠旷场实验的影响3种品系小鼠白天前10 min测试结果中，BALB/c活动量雄性高于雌性(P(BFD；BMD)=0.006)，C57BL/6和昆明雌雄小鼠则差异均无统计学意义；夜间测试结果显示KM雌性小鼠活动量显著高于雄性(P(KFN；KMN)＜0.001)，C57BL/6和BALB/c雌性和雄性活动量未见差异(图2A)。后40 min结果与前10 min一致(P(BFD；BMD)=0.011，P(KFN；KMN)＜0.001，图2B)。

图1 不同品系小鼠在旷场中探索活动和自发活动结果Fig.1 Effects of strain on mice exploratory behavior and spontaneous activities in OFT(n=8)

图2 不同性别小鼠在旷场中探索活动和自发活动结果Fig.2 Effects of sex on mice exploratory behavior and spontaneous activities in OFT(n=8)

2.3 生物节律因素对3个品系小鼠旷场实验的影响3种品系雄性小鼠在前10 min不同测试时间测试结果差异均无统计学意义；雌性小鼠则只有C57BL/6昼夜结果未见差异，BALB/c和昆明小鼠均表现夜间活动多于白天(P(BFD；BFN)=0.013，P(KFD；KFN)＜0.001，图3A)。后40 min，结果与前10 min一致(P(BFD；BFN)=0.008，P(KFD；KFN)＜0.001，图3B)。

图3 不同节律条件下小鼠在旷场中探索活动和自发活动结果Fig.3 Effects of circadian rhythm on mice exploratory behavior and spontaneous activities in OFT(n=8)

2.4 品系、性别、节律对小鼠旷场实验结果影响的三因素析因分析结果对探索活动的析因方差分析结果表明品系、节律对小鼠旷场实验中探索活动有影响；品系与性别、性别与节律的交互作用有统计学意义(P(品系*性别)=0.012，P(性别*节律)=0.016)；品系、性别与节律的交互作用有统计学意义(P(品系*性别*节律)= 0.013)。通过比较不同组合下的均值可以得出：3种品系中，C57BL/6小鼠探索活动均低于BALB/c和昆明小鼠，其中，雄性C57BL/6小鼠在白天探索活动最少。

对自发活动的析因方差分析结果表明品系、性别、节律对小鼠旷场实验中自发活动有影响；品系与性别、性别与节律的交互作用有统计学意义(P(品系*性别)＜0.001，P(性别*节律)＜0.001)；品系、性别与节律的交互作用有统计学意义(P(品系*性别*节律)= 0.005)。比较不同组合下自发活动均值可得出：C57BL/6自发活动显著少于BALB/c和昆明小鼠，其中雄性C57BL/6小鼠在白天自发活动最少(表1)。

表1 各组小鼠旷场探索活动和自发活动路程结果Tab.1 Results of exploratory behavior and spontaneous activities of each group in OFT()

表1 各组小鼠旷场探索活动和自发活动路程结果Tab.1 Results of exploratory behavior and spontaneous activities of each group in OFT()

前10 min路程反映小鼠对新环境的探索活动，后40 min路程反映小鼠自发活动。

品系性别节律前10 min路程(cm)后40 min路程(cm) C57BL/6雌性(F)白天(D)3 913.09±635.81 9 704.39±1 047.01夜间(N)3 857.01±384.75 9 875.58±932.02雄性(M)白天(D)3 510.14±1 194.35 8 515.29±1 076.94夜间(N)4 009.83±703.69 9 474.95±1 659.52 BALB/c雌性(F)白天(D)3 804.20±708.66 12 446.81±2 826.60夜间(N)4 906.87±567.83 17 339.89±3 575.37雄性(M)白天(D)4 984.51±1 179.64 17 001.08±4 590.25夜间(N)4 968.26±808.78 16 196.60±2 995.43 KM 4 715.58±702.49 11 647.49±2 559.60雌性(F)白天(D)4 490.78±890.69 14 833.01±6 256.62夜间(N)6 434.80±1 192.56 23 378.96±6 191.70雄性(M)白天(D)4 802.79±478.69 14 352.77±1 378.84夜间(N)

3 讨 论

本实验通过不同性别的C57BL/6、BALB/c、昆明小鼠在不同时间点(昼夜生物节律期不同)条件下进行1h旷场实验测试，分析其探索行为与自发活动。旷场实验是一种通过检测动物自主活动(locomotor activity)研究动物行为的实验方法［13］。旷场实验的设计原理是基于啮齿类动物的趋触性(thigmotaxis)，指的是小鼠畏惧开阔、未知、可能存在潜在危险的场所，因而表现出“贴墙”活动［14］的特性。一般认为，旷场实验中小鼠的水平活动(ambulation)反映动物的运动活性，垂直运动(rearing)反映动物对新鲜环境的好奇程度［13］，粪便颗数反映动物在新环境中的紧张状态［5，15］。在未适应敞箱情况下，前10～20 min反映小鼠的探索活动，20～60 min反映小鼠自发活动［9］，60 min后小鼠活动减少，活动趋于稳定，小鼠表现出较明显的昼夜活动特点［16］。在人类漫长的培育过程中，实验小鼠已分化为多个品系如Swiss、ICR、BALB/c、C57BL/6等。其中，C57BL/6和BALB/c小鼠是科学研究中常用但遗传背景差异较大的两个近交系，而昆明小鼠一直是我国特有的并且使用量最大的封闭群小鼠［17-18］。以往研究表明，近交系小鼠与封闭群小鼠在基础活动、学习能力以及对危险的反应等方面相对存在较大差异［19］。

本研究结果发现，C57BL/6小鼠无论是对新环境的探索行为还是自发活动量均显著低于昆明小鼠，而与BALB/c相比，除雌性小鼠在白天探索活动、自发活动无差异外，其他情况下均显著更低，似乎在面对新环境时存在更明显焦虑样行为，此结果也在相关研究得到印证［17］。而因处于焦虑状态的动物前10～20 min的活动记录低，给予动物抗焦虑药物后这段时间的运动会相应增高［9］，由此结合本研究结果，我们认为，为获取更准确、更稳定的结果，在为焦虑相关疾病及其相关神经行为实验选择实验动物时，应优先考虑C57BL/6小鼠。

性别因素对小鼠旷场实验的影响主要体现在自发活动上，探索活动受性别的影响则不明显。这可能是因为雌雄本身生理差别而使得小鼠自发活动量受性别因素影响较大，对新环境的探索及其焦虑状态则与性别差异不大。本实验发现，C57BL/6雌雄小鼠在白天与夜间所测探索与自发活动均未见明显差异，BALB/c雄鼠在白天旷场活动显著高于雌鼠，夜间则未见明显差异，而昆明小鼠则是雌鼠在夜间自发活动高于雄鼠，白天未见差异。据此，我们认为C57BL/6小鼠可能比较适用于需去除或淡化性别因素的实验中。

在同等条件下，C57BL/6小鼠旷场结果不因昼夜节律而产生差异，而昆明和BALB/c却只有雄性小鼠在白天和黑夜的探索行为及自发活动量上未见明显差异，雌性小鼠在探索行为和自发活动量上则均表现为夜间比白天高。昆明和BALB/c雌性小鼠在昼夜节律上表现出差异，可能是由于雌鼠相比雄鼠而言更易受性激素影响从而对昼夜节律作用的本实验产生干扰，而雌性C57BL/6受此影响则较小。根据研究报道，C57BL/6雄性小鼠在上午与下午的旷场测试中差异没有统计学意义［20］，可见C57BL/6雄性小鼠在一天多个时间段的活动均较稳定。故本研究结果提示，在实验不好控制昼夜节律因素时，为获取较可靠结果，实验动物可选择C57BL/6小鼠。

综上所述，在本实验中近交系C57BL/6小鼠对新环境的探索活动少，自发活动量低，在不同性别、昼夜节律条件下表现比较稳定，可见C57BL/6小鼠是可用于神经行为学研究的“黄金品系”［21］。

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(编辑 国 荣)

Effects of strain，sex and circadian rhythm on open field test on mice

LIU You-ping1，LIU Tian2，BI Hang2，ZHANG Lei1，DANG Yong-hui3
(1.Zong Lian College，2.Qi De College，3.College of Medicine&Forensics of Health Science Center，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo investigate the effects of sex，strain and circadian rhythm on open field test(OFT).MethodsBy using OFT，we analyzed exploratory behavior and spontaneous activities of male and female Kunming BALB/c and C57BL/6 mice in new surroundings in the day time or at night.Results①The exploratory behavior and spontaneous activities of C57BL/6 mice were significantly fewer than those of Kunming and BALB/c mice.②The exploratory behavior and spontaneous activities of male and female Kunming and BALB/c mice in the day time presented significant differences compared with those at night.③The exploratory behavior and spontaneous activities of female Kunming and BALB/c mice were significantly more at night than in the day time.ConclusionC57BL/6 mice had fewer exploratory behavior and lower spontaneous activities in novel surroundings.And sex or circadian rhythm had relatively small effects on OFT in C57BL/6 mice.C57BL/6 mice are suitable for research on neuroethology and anxiety disorders.

open field test；exploratory behavior；spontaneous activity；strain；sex；circadian rhythm；neuroethology；BALB/c mice；C57BL/6 mice；Kunming mice

R338

A

1671-8259(2014)05-0634-05

10.7652/jdyxb201405013

2013-10-10

2014-01-01

国家自然科学基金资助项目(No.81171262，81371473)；国家级大学生创新训练基金项目(No.201310698072) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81171262，81371473)and the National Innovation Training Program for University Students(No.201310698072)

党永辉，副教授.E-mail：psydyh@mail.xjtu.edu.cn

刘友平(1993-)，男(汉族)，本科在读.E-mail：jiangxiyouyou@stu.xjtu.edu.cn

时间：2014-07-22 16∶19 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1619.005.html