动脉粥样硬化的转化医学研究进展

刘恩岐，范江霖

(1.西安交通大学心血管研究中心脂代谢和动脉粥样硬化实验室，陕西西安 710061；2.西安交通大学医学部实验动物中心，陕西西安 710061；3.日本山梨大学医学部分子病理学教研室，日本山梨 409-3898)

◇专家述评◇

动脉粥样硬化的转化医学研究进展

刘恩岐1，2，范江霖3

(1.西安交通大学心血管研究中心脂代谢和动脉粥样硬化实验室，陕西西安 710061；2.西安交通大学医学部实验动物中心，陕西西安 710061；3.日本山梨大学医学部分子病理学教研室，日本山梨 409-3898)

专家介绍

刘恩岐，医学博士，教授，病理学和病理生理学、药理学博士生导师。现任西安交通大学医学部实验动物中心主任，西安交通大学心血管研究中心PI。研究方向为实验病理学、药理学和实验动物学。近年来，主持国家自然科学基金等科研项目10余项。利用动物模型研究人类动脉硬化相关疾病及脂质代谢取得重要进展，在国际期刊发表重要学术论文40余篇；现任Res J Biol Sci，World J Herpetol等期刊编委；国际动脉粥样硬化学会中国分会理事、中国病理生理学会动脉粥样硬化专业委员会委员、中国实验动物学会常务理事、陕西省实验动物学会会长、陕西省医学会生殖内分泌分会副主委、陕西省医学会病理学会常委。

动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)是威胁全人类健康、导致死亡率最高的疾病，ASCVD病理基础是动脉粥样硬化(AS)。本文回顾了ASCVD流行概况以及AS发生、发展的病理生理过程，总结了ASCVD危险因素和新的生物标记。结合自己的研究经验，作者认为C反应蛋白是ASCVD marker而不是maker。基因敲除家兔模型制作成功，对研究人类ASCVD提供了新的手段。本文讨论了美国ACC/AHA最新颁布的《2013版胆固醇治疗降低成人ASCVD风险指南》中他汀治疗降低血脂方案对中国人的启示，并提出当他汀单独使用不能满足抗ASCVD效果时，他汀与其他药物联合使用是一种有效防治ASCVD的策略。

动脉粥样硬化；流行；幼儿；病理；家兔；危险因素；C反应蛋白；他汀

临床上动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)是指一系列由动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)引起的疾病，包括冠脉综合征(acute coronary syndromes)、心肌梗死(myocardial infarction，MI)、稳定或不稳定心绞痛(stable or unstable angina)、冠脉或其他动脉血运重建(revascularization)、卒中(stroke)、短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack)或动脉粥样硬化性外周动脉疾病［1］。ASCVD是心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)最主要类型。

1 动脉粥样硬化是一种现代流行的古老疾病

AS是ASCVD共同的病理基础，AS斑块(plaques)堵塞动脉管腔，使受阻动脉破裂或缺血，引起脑卒中、MI等，造成ASCVD事件［2］。

ASCVD是威胁人类健康、导致死亡率最高的疾病。据世界卫生组织(the World Health Organization，WHO)统计，2008年，全世界1 700万人死于ASCVD，占整个疾病死亡率30%。ASCVD引起的死亡80%发生在低、中等收入国家。2030年，ASCVD死亡人数将增加到2 330万人［3］。我国归因ASCVD死亡人数占总死亡人数大约39%［4］。ASCVD也是发达国家过早死亡最常见的原因。2010年，美国ASCVD相关疾病所致死亡率占整个疾病总死亡率31.9%［5］，比中国低。欧洲每年有435万人死于ASCVD，其中英国占35%［6］。

ASCVD死亡率存在地理分布、性别差异。欧洲中部、东部最高，意大利、法国和日本最低。随着年龄的增长，男性ASCVD死亡率比女性高。除了地理分布和性别因素外，ASCVD也受种族和社会阶层影响。英国境内来源于南亚人群死亡率比平均值高，而来源于加勒比黑人死亡率比平均值低［6］。归因于ASCVD死亡率在相对贫困社会阶层或发展中国家更加显著，并且呈上升趋势。如，MORAN等［7］通过使用计算机模型预测，由于老龄化、吸烟、高血压和其他一些客观因素影响，2030年，中国人ASCVD及相关疾病死亡率将有可能暴涨至73%。相比于发展中国家，发达国家归因于ASCVD死亡率相对较低，且发病率呈现持续下降趋势。如2000～2010年间，美国ASCVD死亡率降低31.0%；与2008年相比，2010年ASCVD所致死亡率下降0.8%［5］。

目前，ASCVD是危害人类健康的第一杀手，让我们误以为这是一种现代病。其实，ASCVD是一种古老的疾病。

现有的证据表明早在5 000年前人类就患有AS。通过电子计算机X射线断层扫描技术发现，1991年在意大利阿尔卑斯山发现的公元前5 300年前冰人(Tyrolean iceman)、3 600年前古埃及木乃伊、公元前700年中国古尸存在AS，在木乃伊主动脉、冠状动脉、颈总动脉、髂动脉和股动脉等发现动脉壁钙化(calcification)现象，在木乃伊中普遍存在的AS表型与现代人AS发生部位和表型特征相似［8-9］。从西安秦兵马俑博物馆中的将军俑隆起的将军肚和肥胖的体型也可以推断，秦代部分人群也具备了患代谢综合征(metabolic syndrome)和AS的基本条件，由此可见AS是一种现代流行的古老疾病。

2 动脉粥样硬化起始于婴幼儿、伴随终生

AS并不是单纯老年病，而是从婴幼儿开始发生、发展，伴随绝大多数人一生的疾病。

1908年，FREMONT-SMITH［10］对死于急性传染病的儿童尸检时发现了AS，并认为急性感染与动脉疾病存在某种联系。到了上个世纪30年代，就有学者提出AS可能发生在婴儿出生前到死亡每一个年龄阶段［11］。ENOS等［12］对朝鲜战争中死亡的18～48岁美国士兵尸检时，发现77.3%的士兵冠状动脉能够看见AS斑块，引起了世人对年轻人AS的关注。HOLMAN等［13］全面分析了年轻人AS发病情况，通过观察1～40岁的526份死亡患者尸检结果，发现婴儿刚出生不久动脉壁开始出现AS脂质条纹(fatty streak)，随后AS病变缓慢发展，8岁以后AS病变进程明显加快，20岁左右出现AS纤维斑块病变(fibrous plaques)并持续到30岁，这时90%尸检病例在主动脉壁可见不同程度的纤维斑块。脂质条纹发展到纤维斑块大约需要15年。该研究有意思的是还发现高加索人(Caucasian)容易患AS。日本学者TANAKA等［14］对1月龄～39岁的2 856日本人群观察结果与HOLMAN等50年前发现有相似之处：1岁以前，29%儿童主动脉出现脂质条纹；1～9岁之间，3.1%和1.9%儿童在冠状动脉和脑动脉出现脂质条纹；10岁以后，冠状动脉和脑动脉AS损伤随年龄增加；20岁左右，脂质条纹发展迅速；30岁以后，纤维斑块迅速增加。年龄、血液胆固醇(cholesterol)水平、血压与AS形成密切相关。另外一项研究也发现，8月龄，45%婴儿动脉内膜(tunica intima)有泡沫细胞形成；10～14岁，61%儿童动脉内膜中出现大量泡沫细胞(foam cell)、脂质条纹；出现严重病变的(advanced lesions)年龄和发病率如下：10～14岁7%，15～19岁14%，20～24岁21%，25～29岁33%，30～34岁61%，30～39岁66%，男性比女性更严重［15］。

从以上几个研究结果可以看出，人类AS开始于婴幼儿时期，婴儿出生第一年就可能出现AS损伤。然而AS发生和发展需要许多遗传和环境有关的危险因素(risk factors)。因此，预防人类AS也应该提前至婴幼儿期［16］。

3 动脉粥样硬化动脉内膜下的慢性病变

动脉壁由里到外由内膜(intima)、中膜(tunica media)和外膜(adventitia)3层构成。内膜是血管壁内层表面，是由一层内皮细胞(endothelial cell)覆盖整个血管内壁，内膜直接与血液接触。与大多数动物不同的是，人动脉血管内膜中有平滑肌细胞(smooth muscle cells，SMCs)；血管中膜也就是中层由细胞外基质(extracellular matrix)和SMCs组成。动脉外膜外层有纤维母细胞、脂肪、神经末梢和营养血管。依据动脉口径和管壁组织结构，动脉可分为大动脉(富含弹性纤维)、中动脉(如冠状动脉)和小动脉(直径小于2 mm)。发生AS动脉一般在肌性动脉(冠状动脉、脑动脉、颈动脉、肾动脉等)和弹性动脉(主动脉)［17］。

严格意义讲，病理学上动脉硬化(arteriosclerosis)指3种不同的动脉硬化疾病，包括AS(病灶中含有脂质和坏死细胞构成的“粥样”成分)、门克伯格氏中膜钙化性硬化(Monckeberg medial sclerosis)(老年性中膜肌性动脉钙化)和微(小)动脉硬化(高血压引起的微、小动脉透明样变和增生)［17］。一般而言，临床上所说的动脉硬化就是指AS。

动脉粥样斑块(atheromatous plaques)的形成是起源于内膜下，持续发展的慢性炎症反应过程。

1829年，法国病理学家JEAN LOBSTEIN第一次提出了AS概念。19世纪50年代，德国病理学家RUDOLF VIRCHOW认为AS是由于细胞在大动脉集聚引起的细胞病变过程，强调炎症，而奥地利CARL VON ROKITANSKY则认为血管损伤和毒素是AS元凶。1910年，德国化学家ADOLF WINDAUS发现AS斑块存在胆固醇，第一次将胆固醇与AS联系起来。3年后，俄国的ANITSCHKOW和CHALTOW用高胆固醇饲料(high cholesterol diet，HCD)在家兔体内成功诱导出AS病变，将胆固醇与AS联系起来是20世纪最伟大的发现之一。到了20世纪70年代，形成损伤应答学说(response-to-injury)，认为机械损伤、毒性、氧自由基等造成血管内皮细胞损伤，进而引起血管内膜改变、形成AS。现在，越来越多的研究证明，慢性炎症和免疫在AS发生和发展中起重要作用［2，6，18］。

基于动物实验和人体研究，现在可以基本勾画出AS发生和发展的过程。AS最初是从位于动脉壁的单层内皮细胞变化开始。在正常情况下，动脉内皮细胞抵抗血液中白细胞在动脉壁粘附，然而，受到血脂异常、高血压或促炎症介质刺激后，内皮细胞能够表达一些粘附分子(adhesion molecules)，促使白细胞粘附在动脉壁。与此同时，血管内皮通透性和内膜下细胞外基质发生变化，促进含胆固醇的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)穿透血管壁进入内膜。内膜中LDL氧化修饰后，通过内吞作用(endocytosis)进入单核细胞源性巨噬细胞，导致巨噬细胞内胆固醇的积累。趋化介质(chemoattractant factor)则直接促使粘附在动脉壁的白细胞迁移到血管内膜，在局部动脉引起AS病变。尽管所有动脉均受到AS危险因素刺激，但可能由于不同部位动脉血流动力学不同，AS病变只分布在整个动脉特定部位。存在正常层流剪切力(laminar shear stress)位置的动脉不发生AS，因为正常层流剪切力能够诱导内皮表达具有AS保护作用相关基因，因而这些部位不易诱发AS。动脉AS病变中最多的白细胞是单核细胞，单核细胞分化成巨噬细胞。吞噬了脂蛋白颗粒的巨噬细胞就变成了显微镜下可见的泡沫细胞。在AS病变中至少有M1和M2两种巨噬细胞表型已经被确定，M1巨噬细胞具有促炎特性，分泌白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子等促炎症因子。而M2型巨噬细胞被认为是“好”的巨噬细胞，具有抗炎作用。除了巨噬细胞外，AS斑块还有一些其他非吞噬性炎症细胞，包括树突状细胞(dendritic cells)，可能起抗原递呈作用；T淋巴细胞和肥大细胞(mast cells)也存在于AS病变中，但其数量远远低于吞噬性巨细胞(phagocytes)。在AS病变中虽然T细胞数量极少，但它有可能在AS斑块形成和稳定性方面起关键作用［19-20］。

在AS形成过程中，募集SMCs从中膜进入内膜、受血小板源性生长因子刺激增殖，进入内膜的SMCs分泌细胞外基质分子，包括间质胶原(interstitial collagen)、弹性纤维，形成纤维帽(fibrous cap)包裹AS斑块中巨噬细胞源性泡沫细胞(或已死细胞)和脂质。由于胞葬作用(efferocytosis)的缺失，加速了细胞碎片和细胞外脂质的沉积，在AS斑块中形成富含脂质的坏死核(necrotic core)［20］。

AS直接后果是流动限制性狭窄，导致组织缺血或者是形成血栓中断血流供应，出现临床症状(如，心脏病发作或中风)。斑块破裂可能通过再生或结疤治愈，但会增加斑块大小。但奇怪的是，临床上发现血栓发生部位并不总是AS斑块最大、血管最狭窄的地方，相反，血栓经常发生在自身破裂斑块，这是一类易损斑块(vulnerable plaque)，通常有薄的、缺乏胶原蛋白的纤维帽，斑块内缺乏SMCs、但巨噬细胞丰富。炎症细胞既能产生胶原溶解酶(collagenolytic enzymes)，降解胶原加速斑块破裂，也能产生炎症介质，引起SMCs死亡、胶原减少［20］。我们通过转基因(transgenic，Tg)家兔模型研究发现，巨噬细胞过表达(overexpression)基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase)12能够促进AS发生和发展［21］。AS斑块中巨噬细胞也产生促凝组织因子(pro-coagulant tissue factor)，诱发血栓形成。另外，AS斑块中微血管形成可能有效刺激、增加斑块不稳定性［20］。

按照AS病理形态学，美国心脏学会(American Heart Association，AHA)将AS为Ⅰ～Ⅵ型。Ⅰ型，泡沫细胞最初聚集；Ⅱ型，多层泡沫细胞，脂纹形成；Ⅲ型，AS斑块前期病变，细胞外脂质形成；Ⅳ型，AS斑块形成伴脂质聚集；Ⅴ型，纤维斑块；Ⅵ型，复合病变，可能有表面破损、出血、血栓、钙化斑块等。其中Ⅰ和Ⅱ型为早期病灶，一般发生在婴儿和儿童。Ⅲ型为中间型病灶，青春期后发展迅速。晚期病灶分为3个主要组织学类型Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ，这些病灶从30岁以后及中老年分别占优势［22-23］。

通过观察AS发生和发展过程，可以看出AS形成是血管内膜下渗透进来的炎症细胞和动脉固有细胞(如SMCs和内皮细胞)相互作用的过程，共同影响AS形成和并发症。经过几十年的努力，虽然我们在研究AS发生和发展过程方面积累了较为丰富的经验，但AS涉及复杂的病理过程，受多种危险因素调节，多种细胞和细胞因子参与其中，关于AS病理过程仍有许多未知，需要我们不断探索、继续深入研究［24］。

4 动脉粥样硬化归因于众多危险因素

1948年，美国在波士顿附近Framingham小镇启动了Framingham心脏研究(Framingham Heart Study)计划，目标是识别ASCVD危险因素。科研人员首次招募了30～62岁Framingham居民5 209人，参与者每2年接受一次详细医学检测。1971年，再次招募了5 124名第1代参与者子女及其配偶，成为了第2代检测参与者；2002年，又招募了4 095名第1代参与者孙及其配偶，成为了第3代参与者。通过60多年持续监测参与者健康状况和生活习惯，Framingham心脏研究不仅仅里程碑式地创造性地提出ASCVD危险因素概念，而且还让人们相信，通过生活方式改变可以预防或减轻ASCVD危害(http：// www.framinghamheartstudy.org/)。

危险因素是一个流行病学概念，定义为当存在或暴露于某种因素时，特定疾病发生危险性增加40%以上，这种因素即为危险因素［6］。对ASCVD产生因果影响的因素称为ASCVD危险因素。

表1所示AS危险因素包括遗传和环境两大类，涵盖了遗传、生活方式、生物化学和生理学特征。AS一些危险因素是可以改善的，而另一些则不能(如，性别和年龄)。致AS的LDL升高是AS主要危险因素，动物实验和临床观察已经证实遗传影响血液脂蛋白水平、肥胖和其他一些危险因素［25］。在很多人群中统计分析发现，AS遗传力(heritability)大于50%。遗传与环境相互作用影响AS。WHO估计，在发达国家超过60%冠心病患者和40%缺血性脑卒中患者发病原因是血浆总胆固醇(total cholesterol，TC)超过了正常水平［6］。

吸烟可以增加ASCVD风险。英国50年研究发现，与不吸烟的人群相比，吸烟人群冠心病死亡率高达60%(严重吸烟高达80%)，其中吸烟人群中50%将遭受到致命MI［26］。现在人们已经普遍认识到，不良的饮食会增加ASCVD风险。WHO估计在发达国家仅有不到30%冠心病患者和20%吸烟者蔬菜和水果消费水平低于600 g/d［6］。

经常运动预防ASCVD。在发达国家预计超过20%冠心病患者和10%脑卒中患者缺乏运动。适度酒精摄入(1～2次/d)会减少ASCVD风险，但如果酒精摄入过多、酗酒，ASCVD风险增大。WHO估计，发达国家男性中2%冠心病和超过5%脑卒中与饮酒有关。超重和肥胖也增加ASCVD风险。发达国家中大约1/3冠心病和缺血性脑卒中患者体重指数(body weight index，kg/m2)大于21［6］。ASCVD也与血管收缩压和血管舒张压有直接关系。INTERHEART研究表明，在西欧22%心脏病与高血压病史有关。糖尿病大幅增加患冠心病风险。患有2型糖尿病男性AS-CVD风险增加2～4倍，女性风险更高(3～5倍)。糖尿病不仅增加了ASCVD风险，而且还放大了ASCVD危险因素(高胆固醇、血压、吸烟及肥胖)［26］。

表1 AS遗传和环境相关的危险因素Tab.1 Genetic and environmental risk factors for atherosclerosis

表1给出了AS传统危险因素，综合主要危险因素(如年龄、性别、体质量、高血压、血脂、糖尿病)，可以综合评分、预测ASCVD事件。产生重大影响是Framingham危险评分(Framingham Risk Score，FRS)，FRS用于预测冠心病患者死亡率、非致死性心肌梗死发生率及CVD事件；其次是Joint British Societies评分，用于评价冠心病死亡率和非致死性心肌梗死等［27］。遗憾的是这两个ASCVD危险评分是基于西方人群观察结果。2013年，美国心脏病学会(American College of Cardiology，ACC)及AHA在共同颁布了《2013版胆固醇治疗降低成人ASCVD风险指南》(《ACC/AHA 2013指南》)，使用汇集队列方程(Pooled Cohort Equations)评估10年ASCVD事件风险(首次发生冠心病或卒中)。《ACC/AHA 2013指南》采用危险因素包括年龄、性别、种族、TC、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein，HDL-C)、LDL胆固醇(LDL-C)、收缩压、降压药、糖尿病状况和吸烟情况。评估危险因素与Framingham危险评分相比增加了种族和糖尿病［1］。对于我国患者来说，以西方人群为观察对象的ASCVD评分模型是否能够应用于临床仍需要进一步研究。

ASCVD除了上面提到的经典危险因素外，不断有新的危险因素被发现。ASCVD危险因素之间是相互关联的，多重危险因素相加会加重ASCVD。

5 CRP是动脉粥样硬化的marker而不是maker

ASCVD生物标志(biomarker)是人类生物体内发生的与AS发病机制有关联的关键事件指示物，是

ASCVD“替代物”，可用于ASCVD诊断、发病预测、确定临床治疗方案和治疗效果评估。生物标志可以是生物活性分子，如前文提到一些危险因素(LDL-C/ HDL-C、同型半胱氨酸、凝血因子)以及甘油三酯(triglycerides，TG)等是ASCVD常见生物标志。临床上使用的可定量的一些成像技术也可以用作ASCVD生物标志。如定量冠脉造影、颈动脉内中膜厚度和血管内超声既可以定性又可以定量反映ASCVD的进展。

经过几十年的不断探索，我们在ASCVD预防、诊断、治疗取得了长足进步，但ASCVD事件仍居高不下、没有得到有效遏制。临床上需要新的生物标志，用于提高ASCVD诊断、治疗效果评估。

很多血浆蛋白与ASVCD相关，但只有极少蛋白经过临床验证可作为ASCVD生物标志。美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration)批准了肌钙蛋白I(troponins，TnI)和T(Tn T)、肌球蛋白(myoglobin)、载脂蛋白A(apolipoprotein A，apoA)、B-型尿钠肽(B-type natriuretic peptide，BNP)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、肌酐激酶MB(creatinine kinase-MB)等6个血浆蛋白用于作为生物标志用于ASCVD常规筛选［28］。心肌组织损伤后分泌TnI和Tn T，对于MI诊断有效；BNP由心肌细胞分泌，是充血性心力衰竭(congestive heart failure)诊断和预后主要观察指标。现在，使用常规方法可以临床检测这些蛋白。

但是，一些重要生物标志究竟是致ASVCD原因(cause)还是伴随标志，需要大量深入研究，如目前引人注目的CRP。

CRP由肝脏分泌，机体发生炎症、感染与组织损伤急性期时，血浆CRP急剧升高，作为一个经典血浆蛋白标记而被广泛用于疾病监测和诊断。临床和实验研究数据表明，血浆CRP升高可能是ASCVD一个危险因素和生物标记［29］。有人认为CRP升高可能有直接导致ASCVD作用。然而，基因修饰(gene modification，GM)小鼠模型研究反而带来更大的争论，不能回答CRP与ASCVD关系［30］。JUPITER (Justification for the Use of Statins in Primary Prevention：an Intervention Trial Evaluating Rosuvastatin)试验表明，降脂药物瑞舒伐他汀(rosuvastatin)可以使血脂正常(LDL-C＜130 mg/d L)但CRP水平升高(≥2.0 mg/L)人群主要ASCVD心血管事件显著降低［31］。JUPITER研究中，瑞舒伐他汀在降低CRP(3.3→1.8 mg/L)同时也显著降低LDL-C(109→55 mg/d L)［31］，不能将ASCVD心血管事件降低仅仅归功于CRP降低。

CRP能不能成为预防或治疗ASCVD靶点(target)？我们实验室利用家兔模型对此开展了一系列研究。

给普通家兔饲喂HCD诱导AS是研究AS最常用的方法之一，我们发现随着家兔AS损伤程度的增加，家兔血浆CRP也逐渐升高。家兔血浆CRP水平、AS斑块中CRP表达量与AS组织损伤程度存在明显相关关系(r=0.632，P=0.000 3；r=0.617，P=0.001 3)［32］。利用栓塞法诱导家兔脑梗塞，家兔血浆CRP水平随着梗塞时间的延长也不断增加，家兔血浆CRP水平与脑梗塞面积正相关(r=0.98，P＜0.01)［33］。除了普通家兔模型外，我们还利用渡边遗传性高脂血症(Watanabe heritable hyperlipidmic，WH HL)家兔，研究了AS与CRP关系，同样发现家兔血浆CRP水平与家兔主动脉弓AS损伤面积、血浆TC水平密切相关(n=115，r=0.573 3，P＜0.000 01；n=132，r=0.391 7，P＜0.000 01)。还证明了家兔血浆和AS斑块中CRP来自肝脏［34］。以上3个实验初步研究结果表明：家兔血浆CRP水平与家兔血浆TC、家兔AS损伤大小/脑梗塞面积关联，CRP可以作为家兔AS生物标记。在研究CRP在普通家兔、AS模型家兔、WH HL家兔表达之后，我们制作了过表达人类CRP的Tg家兔，增加家兔内源性CRP表达。我们发现Tg家兔血浆中人CRP水平高达(57.8±20.6)mg/L。饲喂HCD 16周后，Tg家兔和同窝非Tg家兔血脂水平、AS斑块大小、斑块组成等没有差异。提示过表达人类CRP不影响家兔主动脉和冠状动脉AS［35］。另一项研究表明，增加内源性人类CRP可能具有促进球囊损伤(balloon injury)后动脉血栓形成［36］。随后，我们设法减少WHHL家兔内源性CRP表达，以便研究低CRP水平如何影响AS。我们给WH HL家兔注射了CRP反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)，CRP-ASO治疗16周后，WH HL家兔血浆CRP水平明显降低(雄兔↓61%、雌兔↓56%)，与非治疗组相比，CRPASO治疗组家兔主动脉和冠状AS病变均无明显变化，表明抑制家兔内源性CRP不影响WHHL家兔AS［37］。

通过我们的一组家兔实验，可以发现以下事实：CRP与AS发生和发展密切相关；升高或抑制内源性CRP，不影响AS发展过程，提示CRP不是致AS危险因素。结论：CRP可作为AS生物标记，但以CRP作为治疗AS靶点是不合适的。最近，通过对15个国家、47流行病学调查研究分析显示，CRP基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms)影响人血浆CRP水平，但这种遗传变异造成内源性CRP变化与人冠心病没有关联［38］，支持了我们来自家兔的研究结果。

6 动脉粥样硬化的动物模型

绝大多数应用于人类ASCVD临床方案，最初发展和测试都是围绕动物实验研究来开展的。动物实验研究提供了一个标准遗传和环境控制条件以及标准基因水平操作，这很难适用人体研究；如果初期动物实验显示没有临床作用，该治疗方案可能不必进行人类临床试验；ASCVD药物必须经过动物实验观察其毒性，显示安全性后才考虑临床应用；动物实验提供一个独特视野研究ASCVD病理生理过程和发病原因，通过动物实验也可以发现直接治疗的新靶点［］。

有人分析了1980～2000年间，发表在Nature等7个顶级期刊、平均被引次数889次、随后极有可能进行人体试验的76个动物实验研究项目(论文)，发现只有28个(37%)随后被应用转化到人类临床随机试验(human randomized trials)中，14个(18%)临床随机试验与动物实验结果矛盾，34个(45%)动物实验研究未进行临床转化，不了了之。最终，只有8个相关研究被应用于人类疾病治疗［40］。可以看出，即使发表在顶级期刊、产生广泛影响的动物实验研究项目，绝大多数并不能转化到人类临床实践中去！动物实验和人类临床试验结果不一致，可能原因之一是动物模型将人类疾病一般化了，这些动物模型不能充分模拟人类疾病病理生理特征［41］。

就ASCVD模型而言，20世纪初以来，家兔、小鼠、大鼠、鸽子、猪和猴子等被用来研究AS。我们检索了Pub Med数据库2012年收录、发表在Circula-tion、Circulation Research、Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology、Cardiovascular Research和Atherosclerosis等AS相关5个核心期刊论文，共有184篇论文使用动物模型研究AS。其中，162篇使用GM小鼠，使用普通小鼠、家兔、大鼠、非人灵长类和地鼠论文数分别只有9、6、5、1、1篇，可见GM小鼠模型是目前研究人类AS的核心模型。

虽然小鼠是AS研究占主导地位的动物模型，但普通小鼠HDL占优势、LDL水平低，对饮食中胆固醇不反应，很难诱导AS。近交系(inbred strain)小鼠对饲料诱导AS有一定敏感性。用含胆固醇1.25%、胆酸0.5%和脂肪15%饲料饲喂常用10种近交系小鼠，发现对AS敏感程度从低到高排序如下：BALB/ cJ＜C3H/J＜A/J＜SWR/J＜NZB/J＜129/J＜AKR/J＜DBA/2J＜C57L/J＜C57BL/6［42］。单一胆固醇和单一胆酸饲料不能诱导小鼠血脂升高及AS损伤。可是，含12.5 g/kg胆固醇、5 g/kg胆酸饲料能诱导C57BL/6小鼠出现AS病变，其早期斑块在形态学上与人类斑块相似，但病情进一步发展之后，其病变部位仍然局限于主动脉弓部，且斑块不连续、特点不典型［43］。apoE和LDL受体(receptor)(LDL-r)基因敲除(knock out，KO)小鼠模型出现颠覆了小鼠模型在AS领域应用理念。apoE是清除乳糜微粒(chylomicron)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)受体的配体，而LDL-r是一种细胞膜表面糖蛋白。apoE或LDL-r基因敲除，会引起血浆中VLDL或LDL积累，进而导致AS病变。apoE-/-和LDL-r-/-小鼠饲喂普通饲料也出现胆固醇血症(hypercholesterolemia)和AS［44］。现在，几乎所有研究基因与AS动物实验方案，都要在apoE-/-或LDL-r-/-背景下展开。

动物实验研究在ASCVD研究中不可或缺，但研究ASCVD需要从不同侧面和不同层次去探索；同样，研究ASCVD，不可能仅用小鼠模型完全解决。

家兔属于兔形目(Lagomorphs)动物，和啮齿类实验动物相比，在系统发育上更接近人类。家兔的妊娠周期短、性成熟早、体形较大、容易实验操作，不存在严重的可以传染给人的疾病，也是常用实验动物。家兔脂蛋白特征与人相似(LDL占优势)，脂蛋白代谢方面更适合于人类AS研究［45］。

普通家兔不形成AS，饲喂含3 g/kg胆固醇饲料16周，可以诱导出典型AS病变。WH HL家兔是由LDL-r自发突变选育的家兔品系，普通饲料就可出现高胆固醇血症和AS，其临床特征和病理变化与人家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia)相似，是研究AS最常用动物模型［46］。要了解HCD诱导家兔AS相关技术和方法，可参考我们实验室发表的有关论文［47-49］。

GM动物主要包括转基因(Tg)、基因敲除(KO)、基因敲入(knock in)和基因敲低(knock down)4种类型。ASCVD研究应用最多的是Tg和KO模型。

制作Tg家兔方法主要采用的是将构建好的外源基因直接注射到受精卵的雄原核中，与采用此法制作Tg小鼠过程相似［45］。我们从1994年开始制作Tg家兔，到目前为止已经成功制作了表达肝脂酶(hepatic lipase)［50］、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)［51］、apo(a)［52］、apoB-100［53］、apoE3［54］、MMP-12［21］、VEGF［55］、CRP［35］、apo A-II［56］、apoC-Ⅲ等［57］Tg家兔模型。此外，通过杂交LPL和apo(a)等基因已经被导入到WHHL兔体内，用于研究AS和脂质代谢［45］。

毫无疑问，KO小鼠模型是AS研究的核心模型。传统制作KO方法是利用DNA同源重组(homologous recombination)原理，对胚胎干细胞(embryo stem cell，ES)实施定向打靶突变、制备KO小鼠。由于缺乏成熟ES细胞，利用ES细胞打靶技术制作KO模型在小鼠以外其他物种中没有成功，限制了家兔等其他实验动物使用。

随着生物技术不断进步、KO新技术不断出现并已经成功用于KO动物模型制作。锌指核酸酶(zincfinger nucleases，ZFN)和转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription-activator like effector nucleases，TALEN)可以对DNA双链分子进行切割，形成DNA双链断裂切口(DNA double-strand break)，然后激活细胞内非同源末端连接(nonhomologous end joining)，造成移码突变，从而达到KO目的。常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9，CRISPR/Cas9)中的cr RNA (CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracr RNA (trans-activating RNA)结合形成tracr RNA/cr RNA双链RNA，指导Cas9蛋白在cr RNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的［58］。

利用这3种新技术，我们可以不再依靠ES细胞就可以轻而易举的对任何物种进行基因打靶而获得KO模型。目前，我们和其他课题组已经获得Ig M［59］、apoCIII［60］、RAG 1和RAG 2［61］、以及CD36、LDL-r、Ry R2和apoE［62］KO家兔模型，并将KO家兔模型应用于研究人类AS推向新领域。

7 动脉粥样硬化的预防和治疗

ASCVD是由许多危险因素相互影响、共同作用而形成的伴随终生的复杂疾病。目前，对其发病过程仍有许多未知，遗传、环境和生活方式影响AS发生和发展［6］。在临床上直接针对AS疾病本身寻找预防措施、实施治疗难以操作。Framingham研究创造性提出了危险因素的概念，控制危险因素是目前公认的降低ASCVD风险的有效手段。

临床常规检验提供的血脂参数包括TC、HDLC、LDL-C、VLDL-C、TG等。胆固醇是AS斑块的主要成分，没有胆固醇就没有AS斑块以及由此所诱发的ASCVD。LDL-C和非HDL-C(non-HDL-C)是致AS胆固醇主要形式。因此，积极控制LDL-C或non-HDL-C水平是降低ASCVD风险的关键。

鉴于LDL在ASCVD发生的病理生理机制中的核心作用，并且大量随机化临床研究也证实降低LDL-C可显著减少ASCVD事件风险，因此在降脂治疗中，应将LDL-C作为主要干预靶点［1］。

如何通过干预LDL-C减少ASCVD事件，2013年产生深远影响的《ACC/AHA 2013指南》给出了详尽解答。经过系统性综述、随机对照试验(randomized controlled trial，RCT)及其Meta分析，在治疗获益ASCVD患者中，ASCVD事件减少是通过使用最大耐受剂量他汀(statin)强化治疗而实现的［63］。没有RCT提示LDL-C或非HDL-C应达到某种特定目标值而带来ASCVD事件降低，并且无法评估达到一个更低目标值能够带来多少额外ASCVD风险降低，因而，《ACC/AHA 2013指南》不再设定LDLC或非HDL-C目标值［1］。

虽然循证医学证据已经表明，将LDL-C目标值降为＜70 mg/d L和(或)LDL-C自基线降幅＞50%，可有效稳定和逆转AS斑块［1］，但不设定LDL-C或非HDL-C目标值益处也是显而易见：①避免LDL-C达标的ASCVD患者他汀治疗不充分。对中国人群而言，LDL-C基线水平总体偏低，目标值的存在可能导致更多患者得不到充分他汀治疗；②设定目标值可能导致未经RCT证实的非他汀药物过度使用或多种药物联合治疗，增加潜在不良事件的发生风险。

《ACC/AHA 2013指南》推荐了4类他汀治疗获益人群：①存在临床证据的ASCVD患者；②原发性LDL-C≥190 mg/d L患者；③无ASCVD临床证据，年龄为40～75岁，且LDL-C为70～189 mg/d L糖尿病患者；④无ASCVD临床证据或糖尿病，年龄为40～75岁，LDL-C为70～189 mg/d L，且10年ASCVD风险≥7.5%患者。对于各类患者人群，推荐采用不同强度他汀(阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀)治疗方案，以实现最大临床获益［1］。中国总体人群ASCVD风险和LDL-C水平低于白人与黑人［64］，即使治疗目标相同，他汀适用剂量也应区别于欧美推荐的剂量。

各种《指南》都将他汀类药物干预作为预防和治疗ASCVD的最主要措施，他汀是羟甲戊二酰辅酶A还原酶抑制剂(HMG-Co A reductase inhibitor)，能够抑制内源性胆固醇合成酶、降低LDL-C。他汀还可以通过抗炎等多种效应(pleiotropic functions)抗ASCVD。然而，仍有许多患者使用他汀后不能有效防治ASCVD，另外，临床上也发现他汀剂量增加1倍，LDL-C降幅只增加5～7%(“他汀6规则”)［65-66］，增加剂量意味着增加药物副作用。因此，当他汀不能满足治疗ASCVD效果时，他汀与其他药物联合使用是一种有效防治策略。

普罗布考(probucol)是临床上使用多年的多酚类抗氧化剂，抗AS，西洛他唑(cilostazol)是3型磷酸二酯酶(type 3 phosphodiesterase)抑制剂，抗血小板凝集。他汀和普罗布考、西洛他唑作用靶点不同，这3种药低剂量联合使用有可能比他汀大剂量单独使用更有效。为此，在日本大冢制药株式会社支持下，我们开展了相关动物实验研究。初步研究发现，普罗布考和西洛他唑联合使用能够协同(synergy)增加抗HCD诱导家兔AS的效果［67］。最近，我们比较了阿托伐他汀单独使用与阿托伐他汀+普罗布考+西洛他唑3药联合使用抗AS效果。给日本大耳白家兔饲喂HCD诱导AS形成，同时每只家兔每天给阿托伐他汀0.005 g；2药联合：普罗布考0.3 g+西洛他唑抗0.3 g；3药联合：阿托伐他汀0.005 g+普罗布考0.3 g+西洛他唑抗0.3 g。药物治疗16周后，我们发现3组药物治疗都能降低家兔血浆TC水平以及主动脉AS损伤：3药联合AS斑块面积↓67%、2药联合↓43%、他汀单独使用↓42%，显示药物联合能够额外增加他汀抗AS的效果(图1)。

图1 3药联合抗家兔动脉粥样硬化效果观察Fig.1 Representative aortic atherosclerotic lesions stained with Sudan IV(A)in rabbits after statin alone treatment (statins)，probucol+cilostazol(PC)and probucol+cilostazol+statin combined treatment(APC)for 16 weeks

8 结语

归因于AS的ASCVD是影响全人类健康的重大疾病，预防和治疗ASCVD给人们带来沉重经济负担。据AHA统计，美国人治疗ASCVD费用占全国卫生经费支出17%，并可能持续增长。到2030年，美国ASCVD相关直接医疗费用将从2010年的2 730亿美元增加至8 180亿美元［6］。发达国家基于人群危险因素改善明显降低了ASCVD死亡率［6］，我国ASCVD发病率却在急剧增长，国家和民众负担日益加重［7］。我国人群ASCVD知晓率、治疗率以及他汀类使用率、控制率均显著低于发达国家，ASCVD预防与中国循证医学证据相差甚远［64，68］。

AS病程周期长、发展过程复杂。我们对AS病因知之有限，将来小鼠以外组织特异性KO动物模型有可能培育成功，将更加有助于我们探索AS的病理生理过程。AS发生在婴幼儿时期，提醒我们ASCVD防线应前移至生命早期。在保障儿童身体健康发育基础上，提倡良好生活方式，干预环境相关AS危险因素；依照基于西方人群制定的ASCVD防治策略，寻找适合中国人群的ASCVD干预措施；实施大人群RCT研究、积累循证医学证据；基于中国人遗传变异和生物标志，推行ASCVD个体化防治；大力推进他汀调脂治疗，阻止LDL-C致AS的过程，有可能遏止未来20年中国人群的ASCVD的迅速增长。

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(编辑 韩维栋)

Recent advances in translational research of atherosclerosis

LIU En-qi1，2，FAN Jiang-lin3
(1.Laboratory for Lipid Metabolism and Atherosclerosis，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061；2.Laboratory Animal Center，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061；3.Department of Molecular Pathology，Interdisciplinary Graduate School of Medicine and Engineering，University of Yamanashi，Yamanashi 409-3898，Japan)

Atherosclerotic cardiovascular disease(ASCVD)caused by atherosclerosis is the most frequent cause of mortality in the world.It has been shown that atherosclerosis in the human can be traced back to the ancient time.The process of atherosclerosis starts as early as infancy，and the disease progresses throughout the whole life. In this paper，we first review the epidemiology of ASCVD，and then summarize the pathologic process and risk factors for atherosclerosis as well as some novel biomarkers of ASCVD.Our previous study revealed that C-creative protein，a new biomarker of ASCVD，does not play a role as a maker in atherosclerosis.Knock-out rabbit models can be created by recent novel biotechnologies and will become an ideal and powerful animal model of atherosclerosis.It is well known that statins are potent lipid-lowering drugs by inhibiting the enzyme HMG-Co Areductase，and have been proved effective in preventing and treating ASCVD.The therapy of statins for Chinese patients with ASCVD is recommended based on 2013 ACC/AHA Guideline on the Treatment of Blood Cholesterol to Reduce Atherosclerotic Cardiovascular Risk in Adults.If patients with ASCVD cannot be effectively treated with statins alone，there is a need to have alternative therapies in combination with other drugs.

atherosclerosis；epidemiology；infancy；pathology；rabbit；risk factor；C-creative protein；statins

R543.5

A

1671-8259(2014)05-0565-11

10.7652/jdyxb201405001

2014-06-26

2014-07-05

国家自然科学基金资助项目(No.81070250，81270348)；国家科技支撑计划项目(No.2012BAI39B02)；陕西省科技创新工程重大科技专项(No.2012FWPT-03) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81070250，81270348)，the National Science and Technology Support Program(No.2012BAI39B02)，and the Major Scientific and Technological Projects of Shaanxi Province(No.2012FWPT-03)

刘恩岐(1965-)，男(汉族)，教授，博士生导师.研究方向：动脉粥样硬化.E-mail：liuenqi@mail.xjtu.edu.cn；范江霖(1958-)，男(回族)，教授，博士生导师.研究方向：心血管分子病理学.E-mail：jianglin@yamanashi.ac.jp

时间：2014-07-22 18∶10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1810.016.html