奶牛子宫内膜炎主要致病菌的分离鉴定及药敏试验

胡文举，宋艳画，秦佳辰，石奎林，于文浩，刘远哲，王新庄＊

（1.河南农业大学，河南郑州450002；2.河南广播电视大学，河南郑州450008；3.平顶山市郏县红牛繁育中心，河南平顶山467124；4.河南农业职业学院，河南中牟451450）

奶牛子宫内膜炎是奶牛产后多发的一种生殖系统疾病。患病时不仅影响奶牛的繁育性能，还可诱发其他疾病，重症者可因此丧失经济价值而被淘汰，给奶牛养殖业造成严重的经济损失。病原微生物感染是引发该病的最直接原因，但致病菌的种类和比例因地域、环境和饲养情况不同而有较大差异［1-2］。近年来，随着平顶山地区奶牛养殖规模的不断扩大，奶牛子宫内膜炎的发病率也呈现上升趋势，但有关引起该地区奶牛子宫内膜炎的病原菌种类及其耐药性尚未见报道，给该病的防治造成很大困难。为此，本试验对平顶山地区某奶牛场患病奶牛的致病菌进行了分离鉴定和药敏试验，为该地区奶牛子宫内膜炎的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 选取经临床诊断及B超检查确诊患有子宫内膜炎的河南平顶山地区某奶牛场共29头奶牛，其中产后30d、31d～60d、61d～90d以及91d后患病的奶牛分别为11头、9头、4头和5头。昆明小鼠76只（22g／只～25g／只），其中雌小鼠40只，雄小鼠36 只，均购自河南省实验动物中心。

1.1.2 药品 阿莫西林、氨苄西林、盐酸环丙沙星、恩诺沙星、强力霉素等药品均由中国兽医药品监察所提供。

1.1.3 培养基 肉汤A 培养基、液体硫乙醇酸盐培养基、血液琼脂基础培养基、胰蛋白胨大豆琼脂、麦康凯琼脂培养基、双抗巧克力琼脂培养基、改良沙琼脂培养基、厌氧菌琼脂、MH 肉汤均为青岛高科园海博生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 用1g／L 高锰酸钾对奶牛外阴部清洗消毒后，采用灭菌输精管将适量灭菌生理盐水注入子宫腔中，回抽子宫内容物于含有2mL～3mL灭菌肉汤A 培养基的离心管中，低温条件下立即带回实验室进行分离培养及相关检测。

1.2.2 细菌的分离纯化与鉴定 将采集到的样品接入肉汤A 培养基，37℃恒温培养18h～24h后，分别划线接种于血液琼脂平板、双抗琼脂平板、改良沙氏琼脂培养基和厌氧琼脂中继续培养［3］。挑取生长状态不同的单个菌落，革兰染色、镜检，根据细菌的染色特性并结合菌落形态和生长特性，进行初步判断和分类。然后分别接种到相应的培养基上进行纯化和生化鉴定。

1.2.3 致病性试验 将76只昆明小鼠随机分成19组。第19组为对照组，其他各组腹腔内分别注射1mL各种纯化后的细菌悬液（约12×109cfu／mL）。攻毒后注意观察小鼠的精神状态、饮食和死亡情况。及时剖解死亡小鼠，选取心、肝、脾等脏器进行细菌分离鉴定，检验是否与攻毒菌株相一致。

1.2.4 药敏试验 将待试菌株制成悬液，用灭菌生理盐水调整比浊度，使其达到0.5麦氏单位，然后用MH 肉汤按1∶1 000稀释备用。用菌液将药物按照两倍稀释法进行稀释，使每行各孔的药物浓度依次为：128、64、32、……0μg／mL，然后将96孔塑料板置于各菌株最佳培养环境下培养18h～24h。以无细菌生长孔内所含抗菌药物的最低浓度为最低抑菌浓度（MIC）。每株细菌重复两次，取其平均值。

1.2.5 药敏试验结果判定 各种菌株对不同药物的耐药、中介、敏感临界值按照美国临床实验室标准化研究所（CLSI）推荐的数值标准进行判定［4］。药敏试验中未列入CLSI推荐范围的部分抗菌药物，药敏试验结果判断参考同类药物标准。

2 结果

2.1 细菌分离与鉴定结果

29份样品中共分离出18种（52 株）细菌，有4份样品未分离出细菌，细菌检出率为86.21%。所分离出的细菌中革兰阴性菌26株，占50.0%；革兰阳性菌26株占50.0%；球菌10株，占19.2%；杆菌42株，占80.8%（表1～表3）。29例病例中有13例是由单一病原菌引发，占所有病例的44.8%；其中由蜡样芽胞杆菌引发的有7例，占单一感染病例的53.8%；由产碱假单胞菌引发的有3例，占单一感病例的23.1%。在混合感染病例中，奥斯陆莫拉菌、蜡样芽胞杆菌和大肠埃希菌的检出率较高，共检出14株，占混合感染菌株数的35.9%。由此可见，该地区奶牛子宫内膜炎主要由蜡样芽胞杆菌、奥斯陆莫拉菌、产吲哚金黄杆菌、大肠埃希菌及产碱假单胞菌等细菌引起。

表1 奶牛子宫内膜炎病原菌的鉴定结果Table 1 The identification results of bacteria from cows with endometritis

表2 革兰阳性菌生化鉴定结果Table 2 Biochemical identification results of Gram-positive bacteria

表3 革兰阴性菌生化鉴定结果Table 2 Biochemical identification results of Gram-negative bacteria

2.2 小鼠致病性试验结果

小鼠攻毒后12h内均出现不同程度的精神萎靡、食欲不振等现象。其中大肠埃希菌组在攻毒12 h内出现死亡，24h该组小鼠全部死亡；而表皮葡萄球菌组、屎肠球菌组、乳房链球菌组和志贺菌属组在攻毒后虽然小鼠出现精神萎靡、食欲不振以及呼吸急促等症状，但48h后上述症状开始逐渐消失，72 h已基本恢复正常状态，未见小鼠死亡病例（表4）。说明虽然分离到的细菌对小鼠均有不同程度的致病性，但葡萄球菌、屎肠球菌、乳房链球菌和志贺菌属致病性较低，而大肠埃希菌、苏云金芽胞杆菌、脑膜脓毒性金黄杆菌、产吲哚金黄杆菌、蜡样芽胞杆菌和停乳链球菌致病性较强。

2.3 药敏试验结果

选择检出率高且致病力强的蜡样芽胞杆菌、产吲哚金黄杆菌、奥斯陆莫拉菌、大肠埃希菌、停乳链球菌、苏云金芽胞杆菌、产碱假单胞菌7种细菌进行体外药敏试验。由表5可见，7种细菌对阿莫西林和氨苄西林均表现为耐药性，而对环丙沙星、恩诺沙星和强力霉素均高度敏感。

表4 昆明小鼠致病性试验小鼠死亡情况Table 4 Death situation of pathogenicity test in Kunming mice

3 讨论

引起奶牛子宫内膜炎的直接原因是产后各种病原微生物的感染，但感染病原微生物的种类和比例与地域、季节以及饲养管理水平密切相关，因此各个地区报道分离获得的菌群种类和主要致病菌存在差异。本试验中29头病例共分离出18种（52株）细菌，其中有4头病例未分离得到细菌，这可能是由于患病牛长期用药导致子宫内容物中细菌数量较少或非细菌感染引起的子宫内膜炎。该地区子宫内膜炎致病菌主要有蜡样芽胞杆菌、奥斯陆莫拉菌、产吲哚金黄杆菌、大肠埃希菌及产碱假单胞菌等。该结果与其他研究者报道结果有一定差异。陈星等［5］报道安徽地区奶牛子宫内膜炎致病菌主要以链球菌为主，分离率为61.7%，其次为葡萄球菌分离率为29.8%；凌丁等［6］对南宁市郊子宫内膜炎致病菌进行分离，结果表明葡萄球菌为最主要致病菌，检出率为50%，其次为大肠埃希菌，检出率为23.33%，与李正国［2］对新疆石河子地区分离的致病菌比例相类似；黄璐［7］研究认为，贵阳地区奶牛子宫内膜炎致病菌主要为链球菌，检出率达到74.1%，其次为大肠埃希菌检出率为25.9%。造成这种差异可能与地域有关。本试验29头病例中单一细菌感染的有13头，占病例总数的44.8%，说明该地区患牛主要以单一细菌感染为主。本试验中12头患牛子宫内分离到蜡样芽胞杆菌，占发病牛的48.0%，其中7 头为单独感染蜡样芽胞杆菌；有6头患牛子宫内分离到奥斯陆莫拉菌；有5头患牛子宫内分离到大肠埃希菌，表明这3种细菌可能是导致该地区奶牛子宫内膜炎的主要致病菌，因此在防治过程中应加以重视。产碱假单胞菌虽然只分离出3株，但是均为单一菌感染，在防治的过程中也不可忽视。

表5 分离菌株药敏试验结果Table 5 Drug sensitivity test results of isolated bacteria

致病性试验表明，大肠埃希菌、脑膜脓毒性金黄杆菌、停乳链球菌、苏云金芽胞杆菌、产吲哚金黄杆菌在腹腔攻毒后2d内，均使本组昆明小鼠全部死亡。说明这5种细菌均有很强的致病性。攻毒蜡样芽胞杆菌2d内，有3只小鼠死亡，死亡率达75%，与李浇［8］、凌丁等［6］的研究结果一致，说明该菌株毒力较强。结合该菌株48%的检出率，提示该菌是该地区奶牛子宫内膜炎的主要致病菌。奶牛产后产道内有一定的创伤，来源于场舍环境中的蜡样芽胞杆菌可通过创伤部位感染机体，当机体免疫力低下时，可引起发病［9］。因此，在奶牛围产期应注意产房卫生，定期对产房进行消毒，同时要加强饲养管理，提高奶牛的抗病能力。

药敏试验结果显示，蜡样芽胞杆菌、大肠埃希菌、苏云金芽胞杆菌、产吲哚金黄杆菌、奥斯陆莫拉菌、停乳链球菌、产碱假单胞菌都对阿莫西林和氨苄西林有耐药性。这可能与该牛场频繁使用这2种药物，使细菌产生耐药性有关，治疗时建议尽量不使用；对环丙沙星、恩诺沙星、强力霉素均高度敏感，可做为该地区治疗子宫内膜炎的首选药物。

引起奶牛子宫内膜炎的病原菌比较复杂，与地域、环境、季节关系密切，同一牛场不同季节，致病菌也可能不同。因此，定期进行细菌的分离鉴定和药敏试验，确定致病菌种类，选择最敏感的药物，才能够达到最佳治疗效果［10］，防止抗菌药物滥用使病原微生物产生交叉耐药性。奶牛一旦患有子宫内膜炎，就会给生产带来较大损失，因此奶牛子宫内膜炎防重于治。奶牛子宫内膜炎的直接病因就是产后各种病原微生物的感染，在分娩和产后，奶牛体抗力较弱，产道存在创伤，环境中病原微生物易侵入造成子宫感染。因此，在实际生产中应加强饲养管理，增强奶牛的免疫力，定期对环境进行消毒，减少致病菌的传播，才能降低子宫内膜炎的发病率。

［1］钟 旭，薛立群.奶牛子宫内膜炎研究进展［J］.动物医学进展，2010，31（11）：91-94.

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［6］凌 丁，张业怀，莫文湛，等.南宁市郊奶牛子宫内膜炎病原菌分离鉴定与耐药性分析［J］.广东农业科学，2013，40（5）：111-115.

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［8］李 浇，郑之琬，何 娟，等.重庆荣昌某奶牛场子宫内膜炎蜡样芽胞杆菌的分离鉴定及药敏试验［J］.中国兽医杂志，2012，48（6）：52-54.

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［10］赵玉龙，王 聪，李莹洁，等.石河子某奶牛场乳腺炎病原菌的分离鉴定及药敏试验［J］.上海畜牧兽医通讯，2008（5）：37.