苦马豆生物碱成分薄层色谱分析

白玛桑姆，杨晓雯，马 烽，周启武，刘晓学，王 磊，赵宝玉＊

（1.西北农林科技大学，陕西杨凌712100；2.临沧师范高等专科学校，云南临沧677000）

苦马豆（Swainsona salsula）在青海俗称尿泡草或苦豆子，蒙名洪呼图额布斯，别名羊尿泡、马尿泡、羊卵蛋、红花苦豆子等，是豆科苦马豆属（Sphaerophysa）多年生草本植物。全世界有3种，分布于亚洲，我国仅有有1 种，广泛分布在内蒙古、河北、吉林、辽宁、山西、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆等地。苦马豆为耐盐碱、耐贫瘠、耐干旱植物，多生长于海拔960m～3 180 m 的山坡、草原、荒地、荒漠沙质地、沙滩、戈壁、沟渠旁及盐池周围［1］。青海省海西州都兰县1992年-1998 年间发生大量绵羊苦马豆中毒，共造成2 300余只羊死亡，给当地畜牧业造成较大经济损失。也有资料报道，苦马豆作为豆科植物，营养价值丰富，粗蛋白为15%左右，与苜蓿相当，具有潜在的饲用价值，是一种可利用的植物资源［2］。中医记载，苦马豆味微苦、性平，入药有利尿、止血、消肿等功效，民间用于主治肝硬化腹水、血管神经性水肿、慢性肝炎浮肿等症［3］（《中华本草》1999），具有重要的医学研究和应用价值。目前，国内对苦马豆的研究主要集中在化学成分方面，已从苦马豆中分离出黄酮醇类、异黄酮类、异环烷类、木脂素类、酚酸类、三萜类及甾醇类等成分［4-5］，但其生物碱类成分，特别是毒性成分研究较少。据报道，澳大利亚灰苦马豆（Swainsona canescens）中含有吲哚里西啶生物碱苦马豆素［6］，并确认是导致动物苦马豆中毒的主要毒性成分［7］。王凯［8］对我国青海省引起牲畜中毒的苦马豆生物碱进行了薄层色谱分析，初步认为其含有苦马豆素，但未从苦马豆中分离纯化出苦马豆素单体成分；赵清梅等［9］对苦马豆生物碱成分研究认为，宁夏采集的苦马豆中含有苦参碱，但不含苦马豆素或所含苦马豆素低于检测限。本试验拟通过对苦马豆生物碱成分系统提取、薄层色谱分析和柱层法分离，初步搞清楚苦马豆所含生物碱的种类，确证苦马豆是否含有苦马豆素，为明确苦马豆的毒性成分提供理论依据。同时也可为苦马豆生物碱化学成分生物活性研究及其植物资源综合利用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物样品 苦马豆地上部分全草2012年7月采集于甘肃武威（37°55′40.47″N；102°38′10.95″E），自然风干后，粉碎，过20目筛，送回实验室置于阴凉干燥处保存备用。植物样品由西北农林科技大学生命科学学院常朝阳研究员鉴定。

1.1.2 主要试剂与仪器 氯仿、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、甲醇、乙醇、氨水（分析纯），天津博迪化工有限公司产品；羧甲基纤维素钠、薄层层析用硅胶GF52（化学纯），青岛海洋化工有限公司产品；苦马豆素标准品，西北农林科技大学生物毒素与分子毒理实验室提供；其他试剂均为国产分析纯。旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品；循环水式多用真空泵，郑州长城工贸有限公司产品；可调式电热板，北京科伟永兴仪器有限公司产品；手提紫外分析仪，上海骥辉科学分析仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 苦马豆生物碱系统提取 苦马豆地上部分干草粉5kg，分批次置于圆底烧瓶中，加入适量工业酒精回流提取4h，过滤收集提取液，如此重复提取6次，合并提取液，减压回收溶剂得总浸膏［9］。总浸膏经酸化、碱化处理后，依次用氯仿和正丁醇分段萃取，得到各部位生物碱提取物。准确称取浸膏重量，计算出膏率。

1.2.2 苦马豆生物碱各萃取部分薄层色谱分析取苦马豆酸性氯仿、碱性氯仿和碱性正丁醇萃取部分浸膏少许，甲醇溶解，用毛细管点样于自制硅胶GF254薄层板，置层析缸中上行法展开，待展开剂距薄层板上缘0.5cm 处取出，挥干展开剂。先在紫外光下（254nm 或365nm）观察荧光，然后分别用改良碘化铋钾试剂和Ehrlich′s试剂显色，记录各斑点颜色并计算Rf值。

1.2.3 苦马豆生物碱各萃取部分相对含量分析选取展开效果较好的薄层色谱板，均匀喷洒改良碘化铋钾显色，用华南农业大学提供的平面色谱图像定量分析软件（Image Quan 11）进行分析，测量各萃取部分生物碱显色斑点的相对含量。每个斑点所显现的峰面积除以总峰面积就是与其相对应的生物碱斑点在各萃取部位的相对含量。如薄层板上出现n个清晰斑点，各斑点峰面积分别为S1、S2...Sn，每个斑点所代表的生物碱相对百分含量为X1、X2…Xn。通过下列公式计算苦马豆生物碱各萃取部分所含生物碱成分的相对百分含量。

1.2.4 苦马豆生物碱硅胶柱层析分离与纯化 称取碱性正丁醇萃取部分浸膏适量，与柱层析用硅胶1∶1重量比拌样，干法上样于预先装好的硅胶层析柱，静置30 min～1h，用氯仿∶甲醇∶氨水∶水（70∶26∶2∶2）体积比的洗脱剂洗脱，每50mL 收集1份，连续洗脱若干份，薄层色谱检测，相同相近部分合并。

2 结果

2.1 苦马豆生物碱提取结果

5kg苦马豆干草粉经工业酒精提取得到总浸膏650.2g，出膏率为13%。取200g醇浸膏酸化和碱化处理，氯仿和正丁醇萃取，分别得到酸性氯仿、碱性氯仿和碱性正丁醇萃取部分浸膏3.01g、0.53g和23.13g，出膏率分别为和1.51%、0.27%和11.57%。

2.2 苦马豆生物碱各萃取部分薄层色谱分析结果

2.2.1 酸性氯仿萃取部分薄层色谱分析结果 经不同极性展开剂展开，在紫外光下观察荧光后，分别用改良碘化铋钾和Ehrlich′s 试剂显色，结果发现，在紫外光下可看到显色斑点，而改良碘化铋钾和Ehrlich′s试剂显色无明显斑点，表明酸性氯仿萃取部分生物碱种类很少。

2.2.2 碱性氯仿萃取部分薄层色谱分析结果 经不同极性展开剂展开，在紫外光下观察荧光后，分别用改良碘化铋钾和Ehrlich′s 试剂显色，结果发现，在紫外光下观察显色成线条状，无明显斑点，而改良碘化铋钾和Ehrlich′s试剂显色均出现明显斑点，结果可见，9种不同极性展开剂展开，以氯仿：甲醇＝3∶1；氯仿∶丙酮＝5∶1；氯仿：丙酮＝2∶1；氯仿∶丙酮＝1∶1；乙酸乙酯∶氨水＝20∶1；丙酮∶氨水＝20∶1；甲醇∶氨水＝20∶1，乙酸乙酯∶正丁醇∶氨水＝10∶5∶1；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝10∶10∶1体积比展开体系效果好，改良碘化铋钾显色得到5个斑点。可见氯仿∶丙酮＝2∶1斑点Rf值及颜色为0.05（橘红色），0.09（浅橘红色），0.15（浅橘红色），0.32（橘红色），0.45（橘红色）；由Ehrlich′s试剂可见，8种不同极性展开剂展开，以氯仿∶甲醇＝10∶1；氯仿∶甲醇＝3∶1；氯仿∶丙酮＝5∶1；正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝10∶10∶1；乙酸乙酯∶正丁醇∶氨水＝15∶10∶1；乙酸乙酯∶正丁醇∶氨水＝10∶30∶1；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝10∶10∶1；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝5∶6.25∶1 乙酸乙酯∶正丁醇∶氨水＝15∶30∶1 体积比展开体系效果好，显色得到5个斑点Rf值及颜色0.05（淡紫色），0.11（淡紫色），0.31（淡紫色），0.50（淡紫色），0.69（紫色）。

2.2.3 碱性正丁醇萃取部分薄层色谱分析结果经不同极性展开剂展开，在紫外光下观察荧光后，分别用改良碘化铋钾和Ehrlich′s 试剂显色，结果发现，在紫外光下观察无明显斑点，而改良碘化铋钾和Ehrlich′s试剂显色均出现显色斑点，结果可见，以甲醇∶氨水＝20∶1；正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝10∶10∶1；正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝10∶15∶1；正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝30∶15∶1；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝10∶10∶1；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝4∶6∶1；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝4∶8∶1。由可见7种不同极性展开剂展开，正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝10∶15∶1体积比展开体系效果好，改良碘化铋钾显色得到4个斑点Rf值及颜色0.05（浅橘红色），0.16（浅橘红色），0.23（浅橘红色）0.31（浅橘红色）。由Ehrlich′s试剂显色可见，4种不同极性展开剂展开，以正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝10∶10∶1；正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝10∶15∶1；正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝30∶15∶1，；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝5∶6.25∶1。以正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝30∶15∶1体积比展开体系效果好，显色得到6 个斑点Rf值及颜色0.09（紫色），0.23（淡紫色），0.34（淡紫色），0.42（淡紫色），0.55（淡紫色），0.63（淡紫色）。

2.3 苦马豆碱性氯仿萃取部分生物碱相对含量测定结果

从以上薄层色谱显色结果可以看出，苦马豆酸性氯仿、碱性氯仿和碱性正丁醇萃取部分用改良碘化铋钾和Ehrlich′s试剂显色，酸性氯仿萃取部分无明显显色斑点，碱性氯仿萃取部分显色斑点明显，而碱性正丁醇萃取部分虽然显色，但成点性差。因此，本试验仅对碱性氯仿萃取部分生物碱成分相对含量进行测定。乙酸乙酯∶正丁醇∶氨水＝10∶5∶1体积比展开，改良碘化铋钾显色有5个斑点，每个斑点相对含量结果见表1。可见斑点⑤相对含量最高为36.24%，可能是苦马豆碱性氯仿萃取部分中主要生物碱成分。

2.4 苦马豆碱性正丁醇萃取部分柱层析分离结果

碱性正丁醇萃取部分硅胶柱层析分离，氯仿∶甲醇∶氨水∶水（70∶26∶2∶2）体积比的洗脱剂洗脱，共收集60份洗脱液，经薄层色谱检测，合并为5部分，1～5 组份改良碘化铋钾显出1 个橘红色斑点；6～15组份改良碘化铋钾显出4个橘红色斑点；16～25组份Ehrlich′s试剂显出2淡紫色斑点；26～40组份Ehrlich′s试剂显出1紫色斑点，与苦马豆素标准品对照，斑点Rf值一致；41～60组份改良碘化铋钾和Ehrlich′s试剂不显色。

表1 碱性氯仿部分生物碱相对百分含量的测定结果Table 1 The determination results of the relative contents of the part of alkaline chloroform alkaloids

3 讨论

生物碱主要是存在于植物中的一类含氮有机化合物，大多数有复杂的环状结构，氮素多包含在环内，具有碱性和显著的生物活性，往往是植物中重要的有效成分或毒性成分。目前科学家也从海洋生物、微生物及昆虫的代谢产物中发现许多有机含氮化合物。生物碱种类很多，已经明确结构的国内外约在10 000种左右，按其化学结构可分吡咯烷类、吡啶类、异喹啉类、吲哚类、莨菪烷类、咪唑类、喹唑酮类、甾体类、二萜类、有机胺类等60 多种类型。按照极性可分为强极性、中等级性和弱极性三类［10］。本试验根据生物碱极性强弱，按照系统提取原理，对苦马豆地上部分生物碱进行系统提取，采用不同极性溶剂分为酸性氯仿、碱性氯仿和碱性正丁醇三部分。结果200g苦马豆醇浸膏经酸化和碱化处理，氯仿和正丁醇萃取得到酸性氯仿、碱性氯仿和碱性正丁醇萃取部分3.01g、0.53g和23.13 g，出膏率分别为1.51%、0.27%和11.57%，从出膏率可以看出，苦马豆生物碱主要集中在碱性正丁醇萃取部分，属大极性生物碱。薄层色谱分析发现，碱性氯仿和碱性正丁醇萃取部分用经典改良碘化铋钾显色，出现4～5 个显色斑点，且成点性好，表明最少有4种生物碱成分，而用特异性Ehrlich′s显色，出现5～6个显色斑点，表明最少有5种生物碱成分且可能为吲哚里西啶类生物碱。碱性正丁醇萃取部分通过硅胶柱层析分离纯化，洗脱组份经与苦马豆素标准品对照，发现含有苦马豆素，确证了苦马豆中苦马豆素的存在，只是与富含苦马豆素的疯草类有毒植物相比，可能含量低，一般薄层检测不明显，但通过柱层析富集后相对含量增高，再用薄层检测就十分明显。

苦马豆素是最早从澳大利亚灰苦马豆（Swainsona canescens）中分离出的吲哚里西啶类生物碱，因植物而得名，随后，陆续从斑荚黄芪、兰伯氏棘豆、绢毛棘豆、甘肃棘豆、小花棘豆、冰川棘豆、变异黄芪等多种疯草类有毒植物中分离得到，并被证明是疯草类有毒植物引起动物中毒的主要毒性成分［11］。它是一种α-甘露糖苷酶特异性竞争性抑制剂，能抑制蛋白质的糖基化过程，导致肿瘤细胞表面糖蛋白表达异常，抑制肿瘤细胞的生长与转移，而具有良好的抗肿瘤作用。同时，苦马豆素还能刺激机体的免疫系统，促进免疫细胞增生，增强NK细胞杀灭肿瘤细胞的能力［12］。苦马豆素抗肿瘤活性和免疫增强作用，已引起国内外学者的广泛关注，并作为抗肿瘤药筛选的后备药，这为苦马豆作为潜在的药源植物利用提供了理论依据。

苦马豆广泛分布于我国西部干旱、盐碱化天然草地，虽然是一种有毒植物，放牧动物采食后可发生中毒，但作为豆科植物，又具有营养丰富的特点，如能避开其有毒的生物学特性，在苦马豆生长繁茂地区可作为一种高蛋白牧草资源开发利用。

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