两种灭活方法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫效果比较

王全杰，刘洪斌，张智明，王彬，杨鹏欣，窦海燕，孟福强，丁国杰

（哈药集团生物疫苗有限公司研发中心，哈尔滨150069）

两种灭活方法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫效果比较

王全杰，刘洪斌，张智明，王彬，杨鹏欣，窦海燕，孟福强，丁国杰∗

（哈药集团生物疫苗有限公司研发中心，哈尔滨150069）

为对比使用甲醛、二乙烯亚胺（BEI）两种灭活方法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗对猪的呼吸道发病率、肺部病变记分、饲料转化率、日增重、以及猪血清抗体水平等指标的影响，将120头健康仔猪随机分成三个试验组和一个对照组，于7、21日龄对试验组的仔猪进行疫苗接种，所有猪于20、50、80及140日龄采血分离血清，检测血清中猪肺炎支原体抗体水平。结果显示，用BEI灭活的疫苗在呼吸道发病率、肺部病变记分、饲料转化率、日增重、以及猪血清抗体水平等各项指标均好于甲醛灭活的疫苗（P＜0.05），与进口疫苗无显著差异。试验表明，使用BEI灭活方法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫效果好。

灭活；二乙烯亚胺；甲醛；支原体；免疫效果

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的一种慢性接触性呼吸道疾病，俗称喘气病［1］。感染猪慢性、持续干咳，其中育肥前期猪咳嗽最严重。该病能造成猪的日增重和饲料转化率等生产性能指标的明显下降，严重影响经济效益，同时还容易引起其他细菌病毒的继发感染，大幅增加治疗费用［2］。

免疫接种猪肺炎支原体疫苗是防控该病的重要手段之一，接种疫苗可减少肺部损伤，提高料肉比及缩短出栏时间［3］。目前，猪支原体肺炎疫苗主要有弱毒疫苗和灭活疫苗，由于弱毒疫苗需要胸腔接种，操作困难，所以不易于推广普及。灭活疫苗通过肌肉注射进行接种，易于操作，同时生产工艺简单、使用安全、方便、易于保存，并能刺激动物产生高滴度抗体和显著的免疫保护效果［4］。在灭活疫苗的研制中，用到最多的灭活剂是甲醛，甲醛是比较传统的灭活剂，其主要通过对蛋白和核酸的烷化作用，使病毒丧失感染性［5］。二乙烯亚胺（BEI）是另一类良好的病毒灭活剂，其作用原理是破坏微生物核酸，而不影响其蛋白质成分，并保持病毒抗原性［6］。本实验分别用BEI和甲醛对猪肺炎支原体进行灭活并制备成疫苗，并设立进口疫苗作为对照，通过动物试验，比较两种灭活疫苗对支原体肺炎的抵抗能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 1日龄健康杜长大三元杂交仔猪120头（支原体肺炎母源抗体为阴性），由哈药集团生物疫苗有限公司实验动物中心提供。

1.1.2 供试抗原及疫苗 猪肺炎支原体P－5722－3菌株抗原由哈药集团生物疫苗有限公司提供，猪支原体肺炎灭活疫苗（进口）由美国辉瑞公司生产。

1.1.3 主要试剂 二乙烯亚胺（BEI），购自FLUCA公司；硫代硫酸钠购自Alfa公司，甲醛，购自国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠，购自国药集团化学试剂有限公司；猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒，由美国IDEXX公司生产。

1.2 方法

1.2.1 灭活疫苗的制备 将检验合格的菌液（抗原浓度≥108CCU／mL）分成两组。第一组为BEI灭活组，向菌液中加入BEI溶液至终浓度4‰，（37±2）℃下搅拌培养至少24 h。加入硫代硫酸盐溶液（最终浓度4 mmol／L），继续搅拌至少24 h［7］；第二组为甲醛灭活组，向菌液中缓慢加入甲醛溶液至终浓度2‰，（37±2）℃下灭活至少24 h。半成品检验合格后，用磷酸缓冲盐水调整抗原浓度，并调pH至7.0±0.2，加入佐剂后乳化。

1.2.2 试验分组 将试验动物随机分成4组，30头／组，A组为BEI灭活疫苗组，B组为甲醛灭活疫苗组，C组为进口疫苗组，D组为空白对照组。A、B、C组分别于7、21日龄进行疫苗免疫，肌肉注射，2 mL／头，D组注射同样剂量的生理盐水。所有试验猪按照常规饲养进行管理，仔猪于28日龄断奶，70日龄转入育肥舍。

1.2.3 观察指标

1.2.3.1 生产性能指标 注射疫苗后，分别于28、70、155、180 d称量猪体重，并记录饲养各个阶段饲料使用情况。计算并比较各组的日增重及料肉比情况。

1.2.3.2 发病情况统计 在饲养的全程记录试验猪的发病情况，计算呼吸道发病率。

同时，在75日龄时，每组随机抽取10头猪进行宰杀，观察和记录每头猪的肺脏病变情况，通过55分法［8］记分，计算肺炎减少率。

1.2.3.3 抗体检测 每组随机抽取10头试验猪，分别于20、50、80、140日龄通过前腔静脉采血并分离血清，按照ELISA抗体检测试剂盒说明书进行检测，在波长为650 nm处测量和记录样品和对照的吸光度值。检测结果的判定标准［9］：S／P＜0.3为阴性，S／P＞0.4为阳性，0.3≤S／P≤0.4为可疑。

2 结果

2.1 猪生长各阶段平均体重及生产性能试验结果仔猪分别于出生后7日龄和21日龄两次免疫猪气喘病疫苗，接种后免疫仔猪均无过敏反应，没有的临床异常反应，注射部位无肿块和异常反应。表明两种灭活疫苗对仔猪安全性良好。猪生长各阶段的平均体重见表1。

表1 猪生长各阶段平均体重情况表

根据表1中的体重情况，计算出猪生长各阶段的日增重及料肉比，结果见表2。由表2可以看出，在哺乳期内（0～28 d）所有猪日增重相差不大；哺乳期至出栏前，A组日增重均大于B组和D组，A组与C组日增重差异不大。A组和C组饲料转化率高于B组和D组。从全程来看，A组的平均日增重为554.9 g，B组的平均日增重为540.4 g，C组的平均日增重为549.11 g，D组平均日增重为465.9 g，A组与D组差异显著（P＜0.05），与C组差异不显著。D组料肉比为3.07，C组料肉比为2.68，B组料肉比为2.83，A组料肉比为2.63，A组较B组降低0.20，与C组料肉比相当，由此可见，BEI灭活疫苗组免疫猪经济效益较甲醛灭活组免疫猪要好。

表2 猪生长各阶段的生产性能检测结果

2.2 试验猪的呼吸道发病率及免疫猪肺炎减少率75日龄时，对照组的猪发生气喘性咳嗽，呼吸困难，并有明显的腹式呼吸，精神不振，免疫组未见上述症状，每组随机抽取10头猪进行宰杀，观察肺部病变，结果对照猪出现典型的猪喘气病肺部病变，在肺脏心叶、尖叶、中间叶以及膈叶前1／3部位，出现大面积胰样病变，病灶部位切面多汁，猪肺炎记分平均分为14.0；C组免疫猪肺部几乎没有病变，猪肺炎记分平均分为2.3，肺炎减少率为83.57%；B组免疫猪肺部病变情况明显较轻，只有小面积典型病变，猪肺炎记分平均分为6.7，肺炎减少率为59.28%；A组免疫猪肺部仅有少量病变，猪肺炎记分平均分为2.5，肺炎减少率为82.14%，由此可见，A组免疫效果要好于B组。

试验猪约在120日龄时，每天观察咳嗽及喘气情况，10 min／次，连续观察21 d。结果A组和C组免疫猪只有个别几头猪发生气喘性咳嗽，呼吸道发病率分别为0.91%和1.02%；B组免疫猪发生气喘性咳嗽的头数稍稍多些，呼吸道发病率为1.90%；D组免疫猪发生气喘性咳嗽较多，呼吸道发病率为3.5%。结果见表3。

表3 免疫猪肺炎减少率及呼吸道发病率检测结果

2.3 试验猪血清抗体的检测

2.3.1 各组猪肺炎支原体抗体水平的比较 试验猪免疫支原体肺炎疫苗后，各组均产生不同水平的抗体，结果见表4。可以看出，20日龄时，A、B、C三组的抗体水平差异不显著，各个免疫组与对照组的抗体水平差异不大；50日龄时，免疫组的抗体水平均升高，A组与B组抗体水平差异显著，A组抗体水平高于C组，但差异不显著；80日龄时，免疫组的抗体水平开始下降，但A组抗体水平只是略有下降，均高于其他组，A组与B组差异显著；140日龄时，免疫组抗体水平略有回升，A组与B组抗体水平差异显著，A组与C组抗体水平相当，各个免疫组与对照组的抗体水平差异较大。

表4 试验猪肺炎支原体抗体水平检测结果

2.3.2 猪肺炎支原体抗体阳性率变化规律 由表5可以看出，7日龄免疫猪肺炎支原体疫苗后，20日龄时，免疫猪均有猪肺炎支原体抗体产生，其中A组和C组阳转率较高；50日龄时，由于二次免疫的作用，各个免疫组的阳性率快速上升，但是相对于A组和C组，B组抗体阳性率较低；80日龄时，免疫组抗体阳性率下降，A组的阳性率由80%下降到70%，B组的阳性率由40%下降到30%。A组和C组的阳性率差异不显著；140日龄时，所有试验组的阳性率均上升。A组和C组的阳性率明显高于B组和D组。

表5 各组猪血清抗体阳性率统计结果

3 讨论与小结

3.1 生产性能比较 为了更好的了解不同灭活方法对猪肺炎支原体灭活的影响，本实验用BEI和甲醛两种灭活方法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗通过动物试验进行免疫原性比较。结果发现，BEI灭活组免疫猪的日增重、饲料转化率和肺部病变减少率均好于甲醛灭活组免疫猪，和进口疫苗组的免疫效果差异不显著。空白对照组在70 d后，日增重逐渐减少，同时大部分猪出现气喘性咳嗽，并出现腹式呼吸。甲醛灭活组个别免疫猪出现同样的症状。但是BEI灭活组和进口疫苗组均健康存活。这一结果与曹建国等［10］研究的结果相一致。对所有试验组呼吸道发病症状进行观察和统计，BEI灭活组和进口疫苗组的呼吸道发病率低于甲醛灭活组，且与空白对照组差异显著。通过55分法记分比较肺部病变，结果BEI灭活组肺炎减少率在80%以上，远远高出甲醛灭活组的59.28%，由此可见，用BEI灭活的疫苗比用甲醛灭活的疫苗对猪的保护效果要好，能很好的抵御猪肺炎支原体的侵袭。

3.2 抗体水平比较 在猪肺炎支原体免疫保护方面主要是以细胞介导的免疫力为主［11］，但体液免疫力和粘膜免疫力也参与其中，值得一提的是，疫苗诱导产生的抗体水平和阻止病原移行及疾病发生之间联系不大，疫苗抗体水平不一定与保护正相关，只为参考性指标［12］。本研究对免疫猪生长过程中各个阶段的抗体水平和抗体阳性率等指标进行了跟踪记录，在20日龄时，所有试验猪的抗体水平均较低，并且差异不显著，这可能表明，在7日龄时注射的疫苗在此时还未能刺激机体产生较高浓度的抗体水平，这一试验结果与Villsrreal等［13］报道的猪在接种疫苗3周后可检测到抗体的结果相似。从抗体水平和阳性率的数值上来看，BEI灭活组和进口疫苗组的抗体产生差异不显著，均高于甲醛灭活组，并且甲醛灭活组的阳性率处于很低的水平，主要原因在于甲醛作用于病毒的表面蛋白，使病毒抗原的免疫原性降低，并阻碍其对病毒内部核酸的破坏作用［14］，而BEI主要破坏病毒的核酸，使病毒完全丧失感染力，而不损坏病毒的蛋白质衣壳，从而保留其保护性抗原，病毒的免疫原性几乎不被破坏［15］。

综上所述，BEI灭活法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗免疫效果及经济效益要好于甲醛灭活法。

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（编辑：李文平）

Comparive Analysis of the Immune Effects of Inactivated Mycoplasma hyopneumoniae Vaccines with Two Perparation Methods

WANG Quan－jie，LIU Hong－bin，ZHANG Zhi－ming，WANG Bin，YANG Peng－xin，DOU Hai－yan，MENG Fu－qiang，DING Guo－jie∗
（Harbin Pharmaceutical Group Co.，Ltd，Biological Vaccine，Harbin 150069，China）

The immune effects of two inactivated Mycoplasma hyopneumoniae vaccines prepared with formaldehyde and ethylene imine（BEI）were compared respectively，including incidence of respiratory disease，lung lesion score，daily weight gain，feed efficiency ratio and porcine serum antibody levels.120 healthy piglets were randomly divided into three experimental groups and a control group.The piglets in experimental groups were vaccinated at the age of 7 and 21 days.At 20，50，80 and 140 days of age，we separated blood serum of all pigs，and detected the antibody level of Mycoplasma pneumonia in serum.Results showed that，BEI inactivated vaccine do better than the formalin inactivated vaccine in the aspects of respiratory morbidity，lung lesion score，daily weight gain，feed conversion rate and porcine serum antibody titer.However，compared BEI inactivated vaccine with the imported vaccine，there was statistically significant difference（P＜0.05）.The result indicated that the immune effect of inactivated Mycoplasma hyopneumoniae which was inactivated with BEI was better.

nactivate；binary ethylenimine；formaldehyde；Mycoplasma；immune efficacy

2014－08－25

A

1002－1280（2014）11－0019－05

S859.79＋7

王全杰，硕士，从事动物疫苗研究

丁国杰。E－mail：dingguojie1974＠126.com