甘草酸抗氧化作用及对糖尿病肾病的作用研究*

卢世明 刘占英 任焕焕 高 滨

(昌邑市人民医院，山东 昌邑 261300)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病较为常见的慢性并发症之一，研究发现DN的发生、发展及预后与血糖水平密切相关，高血糖所引发的氧化应激是DN的发病主要原因。本研究在对糖尿病大鼠模型测定其组织丙二醛、超氧化物歧化酶水平，并采用抗氧化剂α-硫辛酸及具有抗氧化性作用的甘草酸进行相关的干预治疗，以研究甘草酸对DN的抗氧化应激作用。

1 材料与方法

1.1材料 本研究中的6周龄Wister雄性大鼠，均来源于山东大学动物实验室，体重为180～200 g，喂养及处理药物的来源如下：链脲佐菌素(美国Alexi公司)，α-硫辛酸(德国史达德药厂)，甘草酸(南京正大天晴制药有限公司，国药准字号H20051942)，DL-甘油醛(美国Sigma公司)，NADPH(美国 Roche 公司)，Bcl-2、Bax免疫组化测定药盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，H-7500透射电镜(日本HITACHI公司)。

1.2方法 所有大鼠均进行适应性喂养1周，随机抽取10只大鼠进行正常饲料喂养，其余30只作为糖尿病组，进行如下干预，于大鼠左下腹注射链脲佐菌素溶液，72h后采用罗氏血糖仪检测血糖，若血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病模型建立。30只大鼠分为糖尿病对照组、α-硫辛酸治疗组及甘草酸治疗组，每组各10只。每日采用灌胃处理，α-硫辛酸组10 mg/kg˙d-1，甘草酸组30mg/kg˙d-1，4组大鼠分别采用等容量的生理盐水1 ml/100g˙d-1，灌胃第4,8,12,16周开始测定血糖及留取24 h的尿液测定大鼠的白蛋白含量，于第16周后处死大鼠，采用10%水合氯醛按400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，取大鼠的右肾相关组织放于4%的中性甲醛液中进行固定，后进行HE染色，将左肾的少量皮质切成约1 cm3的小块，后置放于3%的戊二醛溶液中固定，电镜下观察。取左肾剩余皮质称重，置于-70℃冰箱保存，进行丙二醛、超氧化物歧化酶测定。肾脏病理观察采用常规HE染色。

1.3统计学处理 所有数据结果以表示，采用SPSS11.5统计软件包处理。各组数据间的比较采用t检验和单因素方差分析及重复测量方差分析，P<0.05为有统计学差异。

2 结 果

2.1实验前后大鼠体重与血糖水平 糖尿病对照组1只大鼠于处死前死亡。药物干预试验前各糖尿病大鼠体重与正常对照组均无明显差异(P>0.05)，各糖尿病大鼠血糖均显著高于正常对照组(P<0.01)；治疗16周结束时，正常对照组大鼠体重均显著高于各糖尿病大鼠，(P<0.01)，各糖尿病大鼠血糖均显著高于正常对照组，P<0.05。治疗前，两治疗组血糖与治疗前比较无显著差异(P>0.05)，糖尿病各组间体重无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体重和血糖比较

注：*表示与实验前比较，P<0.001,^表示与糖尿病其余三组比较均有统计学意义，P<0.05

2.2α-硫辛酸、甘草酸对糖尿病大鼠肾脏丙二醛、超氧化物歧化酶的影响 与正常对照组比较，糖尿病各组大鼠肾组织匀浆丙二醛水平显著升高(P<0.01)，超氧化物歧化酶降低(P<0.01)；硫辛酸治疗组、甘草酸治疗组与糖尿病对照组比较，丙二醛水平降低(P<0.01)，超氧化物歧化酶升高(P<0.01)，二者比较无显著性差异。(见表2)

表2 大鼠肾脏丙二醛、超氧化物歧化酶水平比较

注：*表示该项目下该组与其余三组单因素分析，具有统计学差异，P<0.05。

2.3肾脏病理学观察 光镜下可见正常对照组大鼠肾小球毛细血管形态及分布无异常，糖尿病组可见肾小球毛细血管充血、扩张，肾小球明显增大，肾小球系膜区扩张和基膜不同程度增厚，肾小球细胞数目减少，肾小球细胞外基质明显增多，系膜区扩大。而各治疗组间肾小球增大不明显，肾小球系膜细胞和系膜基质轻度增生，较糖尿病模型组病变明显减轻。

2.4电镜观察肾脏病理变化 透射电镜观察正常组肾小球滤过膜结构完整，足细胞足突分布均匀，甚至可见裂系膜，肾小球基底膜厚度正常，内皮细胞排列整齐。而糖尿病组肾小球滤过膜结构明显异常，内皮细胞排列紊乱、脱落，完整性破坏，足细胞部分高尔基复合体出现电子密度增高，线粒体出现嵴断裂，空泡样改变，裂隙膜缺失，肾小球基底膜厚薄不均。而两治疗组可见肾小球滤过膜结构有损害，但与糖尿病组比较有明显改善，足细胞线粒体，高尔基复合体未见明显异常，突起间可见裂孔，基底膜增厚减轻，滤过膜结构基本完整。

2.5实验后各组糖尿病大鼠尿白蛋白定量变化 分别于实验后第4，8，12，16周末测定了各糖尿病组大鼠尿白蛋白定量，分析了各组大鼠实验后尿白蛋白量的变化。测定结果表明随着实验时间的进展，糖尿病组大鼠尿白蛋白有上升趋势，用α-硫辛酸和甘草酸治疗后尿白蛋白基本维持不变，治疗16周末，α-硫辛酸组、甘草酸治疗组尿白蛋白水平与4周末相当，但糖尿病对照组尿白蛋白定量显著升高，较两治疗组差异显著(P<0.01)。详见表3。

表3 大鼠4～16周尿白蛋白含量变化

注：重复测量分析结果表明，组间比较F=18.620，P<0.01,组内比较f=47.960，P<0.01，交互作用f=24.720，P<0.01,*表示与4周末两两比较，p<0.01,^表示与8周末、12周末比较有统计学差异，p<0.01。

3 讨 论

糖尿病肾病(DN)是终末期肾病最主要的原因之一，DN的发生发展与血糖升高程度、持续时间密切相关，氧化应激在高糖条件下的过度激活引起各种代谢异常是发生DN的重要原因之一，应用抗氧化剂防治DN受到广泛关注[2,3]。

本实验中我们发现，糖尿病大鼠肾脏组织中丙二醛水平升高、超氧化物歧化酶活性下降，用抗氧化干预治疗后，肾脏组织的丙二醛水平下降、超氧化物歧化酶活性升高，说明糖尿病时，高血糖通过增加肾脏氧化应激参与DN的发生发展。本研究观察了典型的抗氧化剂α-硫辛酸及中药甘草酸对于DN的有效防治作用，通过肾脏的病理性切片染色及电镜下的观察发现糖尿病大鼠的肾小球结构出现基底膜增厚，治疗组大鼠的基底膜变化情况获得显著减轻，且伴随着实验时间的增加，糖尿病大鼠的尿蛋白出现明显的上升趋势，采用α-硫辛酸和甘草酸治疗后尿道白水平基本维持不变。因此，我们认为抗氧化治疗对糖尿病肾脏的病理损害有明显的保护作用。

现代药理学研究表明，甘草酸是甘草中的主要活性成分，是一个最重要的甘草甜素类化合物，具有广泛的生理及药理作用，如抗炎症、免疫抑制、抗氧化、抑制血小板聚集，降血脂与抗动脉粥样硬化等[4]。本研究发现甘草酸具有明显抗氧化的作用，其作用效果与典型抗氧化剂α-硫辛酸相近，可改善糖尿病肾病动物模型肾脏病理变化、减少尿蛋白生成，因此我们认为，中药甘草酸在防治DN中有较好的临床应用前景。

[1] Samudio I, Wilersonn IT, Nagaev I, et al. DCCT:The Diabetes Control and Complications Trial Research Group.The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus[J]. N Engl J Med， 1993，329:977-986.

[2] Wu J, Zhang R, Torreggiani M, et al. Induction of diabetes in aged C57B6 mice results in severe nephropathy: an association with oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, and inflammation[J]. Am J Pathol，2010 ，176(5):2163-2176.

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[4] 李开龙,张建国,王慧民,等.甘草18α体对梗阻性肾病大鼠肾间质中NF-κB表达的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志,2004,20(1): 31-33.