富氢水预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护研究*

孙丰伟 韩玉刚 孟令国

(1. 泰山医学院附属医院，山东 泰安 271000; 2. 山东省电力中心医院，山东 济南 250001)

肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)是个复杂的病理过程，与许多临床疾病的进展过程相关，如肝胆手术、肝脏移植、休克及毒性肝损害、静脉阻塞性疾病如Budd-Chiari综合征等。其病理特点主要是由Kuffer细胞、淋巴细胞及中性粒细胞的活化引起组织细胞坏死、程序性凋亡等。另外，肝细胞损害可以导致器官微循环障碍，进一步加重组织缺血缺氧，最终导致肝功能不全、器官功能衰竭等。因此，HIRI是一个棘手的临床课题，积极预防和有效干预具有重要的临床意义。本实验制造大鼠部分肝脏缺血再灌注损伤模型，以富氢水口服，通过对肝功能转氨酶及抗氧化酶的检测，对大鼠肝脏缺血再灌注后损伤进行评价，并探讨HS在肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用。

1 资料和方法

1.1实验动物 实验所用大鼠为远交系封闭群雄性SPF级Sprague-Dawley (SD)大鼠，周龄6～8周，体重220～250 g，由山东农业大学实验动物中心提供。实验前于本实验室内分笼饲养1周，使大鼠适应环境。实验室温度控制在18～22 ℃,室内相对湿度40%～70%，保持空气流通，自然昼夜光线下饲养。实验期间动物自由饮用自来水，进食标准颗粒饲料，术前12 h禁食，自由饮水。

1.2大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型的建立 大鼠术前12 h禁食，自由饮水。手术前3天口服富氢水(40 ml·kg-1·d-1,分两次服)。建立肝脏缺血再灌注损伤模型：10%水合氯酸(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，取仰卧位固定，常规消毒，上腹正中切口进腹，沿腹部中线切开腹腔，以生理盐水纱布覆盖、下推肠管，暴露肝门，用动脉夹(哈巴狗)分别阻断左、中叶(约占全肝70%)肝动脉支(保留门静脉血流)，完全阻断左、中叶肝脏动脉血流，造成受累肝叶缺血缺氧，保留肝右叶、尾状叶(约占全肝30%)血供。以温盐水冲洗腹腔，以1号丝线做连续缝合关腹。肝门部分阻断60min后去除肝蒂阻断夹，恢复肝脏灌流。

1.3确定取样时间点 检测缺血60 min再灌注2、6、12、24 h大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)谷草转氨酶(AST)水平的变化曲线，以此作为肝脏损伤指标，确定取样的时间点。

1.4实验动物分组和富氢水用法 采用随机数字表法，将30只大鼠随机分成3组(n=10)：(1)假手术组(Sham组)：仅暴露肝门，不夹闭动、静脉；(2)缺血再灌注组(IR组)：建立肝缺血再灌注损伤模型，夹闭左、中叶门静脉和肝动脉支60min后恢复灌注；(3)富氢水组(HS组)：建立肝缺血再灌注损伤模型，手术前3天口服富氢水(40 ml·kg-1·d-1,分两次服)。Sham组和IR组同等时间口服等量生理盐水。

1.5标本收集和处理 实验结束后，动物禁食、自由饮水，至取样时间点用10%的水合氯醛(0.35 ml/100 g)经腹腔内注射麻醉后开腹，经下腔静脉取血约3 ml，3000 rpm离心15 min分离血清，-70 ℃冰箱保存，各组分别于缺血60 min再灌注至预定时间后，经下腔静脉抽取静脉血，分离血清，检测时应用HITACHI7600型全自动生化分析仪测定血清中ALT、AST含量。

2 结 果

IR组缺血再灌注后6h血清ALT、AST水平比Sham组明显升高，HS组与IR组相比均降低，差异有统计学意义(P<0.01)；IR组和HS组缺血再灌注后6 h与Sham组比较，GSH含量下降明显(P<0.01)，而HS组GSH含量均高于IR组，差异显著(P<0.05)，见表1。

表1 各组血清转氨酶含量和肝组织GSH水平比较

注：与Sham组比较，aP<0.01bP<0.05 与IR组比较，cP<0.01。

3 讨 论

肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)是肝胆外科和创伤外科疾病常见的病理生理过程，如严重的肝外伤、肝叶切除手术、肝移植及休克、感染等，如何减轻缺血再灌注损伤一直是医学界研究的重点和难点[1]。肝脏是对缺血再灌注损伤最敏感的器官之一(仅次于脑、肾)，肝窦内皮细胞和中性粒细胞的活化以及氧自由基的产生，在缺血再灌注损伤的病理过程中具有重要作用。肝细胞受损后结构破坏，细胞通透性增强，致使胞内的丙氨酸氨基转移酶等渗出胞外进入血液，因此常以血液中以转氨酶含量增高作为肝细胞损伤程度的指标[2]。

缺血再灌注损伤(Ischemia-Repeifusion injury,IRI)的概念是Jennings于1960年首先提出的，是指缺血器官、组织重新获得血液供应之后，进一步加重了器官、组织功能代谢障碍及结构破坏的现象[3]。Toledo等在1975年认识到再灌注损伤是肝移植手术中的重要损伤状态，可引起移植肝淤血、进展性血栓形成，最终导致移植失败[4]。直到上世纪80年代，“再灌注损伤”才逐渐在文献中见到。肝脏不同于腹腔内的其他器官，血液供应非常丰富，具有双重的血液供应，入肝血管包括肝固有动脉和门静脉。肝血供的20%来自肝动脉，是来自心脏的动脉血，主耍供给氧气；肝血供的80%来自门静脉，是来自消化道的静脉血，主要供给营养。两者受交感祌经支配以调节血量，具有互补作用。肝脏手术过程中肝蒂阻断法(Pringle法)，即在第一肝门处同时阻断肝动脉和门静脉血流，是目前临床上最常采用的肝血流阻断法，适用于在各种肝切除和肝移植手术，因此虽然肝脏有双重的血液供应，仍不能完全避免缺血再灌注损伤。肝脏缺血再灌注损伤的作用机制十分复杂，由多种病理、生理机制参与，包括细胞缺血损伤、促炎性介质的产生、超氧自由基的释放、钙超载、粘附分子的表达以及细胞调亡坏死等[1]。在肝脏缺血再灌注损伤过程中，通常将再灌注后2h称为早期，以氧化应激和释放反应性氧物质直接导致肝细胞损伤为特征，在这一时期kuffper细胞被激活并释放氧自由基，补体系统活化，所造成的肝损伤较为局限，肝小叶结构仍然保持完整，但氧化应激所引发的诸多细胞因子的释放，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-Ⅱ等进一步介导了晚期继发的炎症反应。再灌注后6～48h为损伤晚期，是中性粒细胞聚集引发的炎症过程，同时也通过释放超氧物质损伤肝细胞。另外中性粒细胞激活释放的弹性蛋白酶、组织蛋白酶、肝素酶、胶原酶和水化酶都对肝细胞有直接损害作用[5]。氧自由基(ROS)在缺血再灌注损伤中起重要作用，缺血期组织细胞含氧量减少，作为电子受体的氧含量不足，再灌注后恢复组织氧供应，使氧自由基在短时间内爆发性增多。氧自由基主要来源于细胞质黄嘿呤氧化酶、Kupffer细胞、粘附的中性粒细胞，在机体内可对蛋白质、脂肪及核酸等几乎所有生物活性物质产生损伤作用[6]。肝脏缺血再灌注后，Kupffer细胞激活释放出的大量细胞因子和巨噬细胞，其产生的活性氧引发Caspase等调亡蛋白的激活促使肝脏实质细胞发生调亡，Kupffer细胞释放的细胞因子如肿瘤坏死因子-α，白细胞介素等，可促使中性粒细胞和内皮细胞表面黏附分子表达上调，两者的结合更加紧密，从而使中性粒细胞进一步越过内皮细胞，转入肝脏实质产生炎症反应[7]，粘附和迁移到肝实质的中性粒细胞释放出大量的氧自由基和蛋白酶进一步加重了肝细胞病理改变[8]，包括细胞的氧化磷酸化水平降低，ATP耗竭，肝细胞内外钙离子重新分布，细胞内钠钙超载，细胞水肿，细胞膜崩解，肝细胞坏死[9]。

近年来肝脏缺血再灌注损伤的防治研究虽然取得了很大进步，包括低温、改良外科技术、药物防治、缺血及药物预处理、基因治疗等方面，但大多处于动物实验阶段，人类临床试验仍相对较少，并面临诸多问题，尚缺乏有确定疗效的治疗方案，仍然需要寻求可以抑制早期氧化应激损伤、阻断晚期炎症反应的有效措施。

目前，在医学领域初步研究结果显示，富氢水中的氢气分子可以降低血脂、血糖，减低肿瘤放疗中的辐射副作用，治疗痛风(高尿酸血症)等。多数处于动物实验阶段，与临床应用尚有距离。前期，人们一直没有重视氢在高等生物体内的作用。在辐射化学领域，曾有人证明在溶液中氢气可与羟自由基直接反应，但没有受到重视。过去，学者认为：氢气属于生理性惰性气体，但是近期的研究发现，氢气虽是生理性惰性气体，但是确属一种非常理想的抗氧化物质，从而开辟了一个新的研究方向：氢分子医学。

氢是自然界最简单的元素，无色、无味、具有一定还原性的双原子气体。氢元素占宇宙物质组成的90%左右，可以说是宇宙最基本的化学元素。氢气是一种优质的抗氧化物质，具有无毒、无残留、制备容易，且为非兴奋剂、非药物等诸多优点，同时，氢气的抗氧化特性还具有选择性：即氢不与氧化作用弱的自由基直接反应，而与氧化作用很强的自由基(造成细胞损害)，如OH和ONOO-直接发生反应[10-12]。与自由基反应的产物也简单，例如与羟自由基反应生成水，多余的氢可通过呼吸排出体外，不会有任何残留，这明显不同于传统抗氧化物质，如维生素C与氧自由基反应生成的“氧化型维生素C”对机体不利的代谢产物，这些产物仍需要机体继续代谢清除。氢的制备容易，价格低廉。因此，氢作为一种抗氧化物质，具有选择性强、无毒、无残留、价格便宜等诸多优点，具有广阔的医学应用前景。

氢的给药途径及方式：氢气的作用具有巨大的医学价值，但是摄入方式需要将氢气与空气混合，存在爆炸的危险。国外有学者采用制备饱和氢气水用于饮用等方法，效果满意。国内学者将纯氢溶解于生理盐水使氢气达到饱和溶解的方法，成功地制造出富氢水，该溶液可以安全地用于静脉注射[13]。研究证明，静脉注射饱和氢溶液对脑梗死、新生儿脑缺血缺氧损伤等均有作用。近期研究发现，富氢水注射液对-小肠移植术后-再灌注所引起的关联脏器损伤具有治疗作用[14]。因此，静脉注射含氢生理盐水是一种临床实用性很强的给氢途径，具有广泛、理想的应用前景。

日本氢分子研究专家采用化学反应、细胞学等手段，证明氢气具有选择性抗氧化作用[15]。国内学者孙学军等通过大量的实验及临床研究证实，动物或人体只需要呼吸氢气或饮用富氢水，就可以对诸如心、脑、肝、肾、肺、小肠等缺血再灌注损伤(I/R)与心脏器官移植后的炎症损伤等具有显著的抑制作用，对糖尿病、中风、慢性氧化应激性疾病具有明显的治疗作用[16-18]。氢气作为一种选择性抗氧化物质，具有很强的临床应用前景，彻底推翻了氢气属于生理性惰性气体的传统观点。并提示，氢气可能是一种新的生物活性分子。

氧自由基是维持正常生命所必需的物质，是能量代谢的基础，部分自由基是细胞内重要信号分子，同时也是细胞的杀手[19]。生理情况下，体内自由基产生、清除维持在一个正常生理水平上，过多或过少均会对细胞造成伤害。生物体内自由基类型有：氧、碳和氮自由基等。氧自由基包括超氧阴离子、单线态氧和羟自由基、过氧化氢等活性氧。在这些自由基中，过氧化氢和一氧化氮具有重要的分子信号作用，毒性很弱，而羟自由基和过氧亚硝基阴离子则具有强毒性，是导致细胞氧化损伤的主要介质[20,21]。因此，寻找选择性对抗羟自由基和过氧亚硝基离子的物质，成为对抗氧化损伤的有效方法。目前，人们在寻找选择性抗氧化物质的研究方面的进展仍然比较慢，比较明确的选择性抗氧化物质比较少，氢是否就是一种理想的选择性抗氧化物质，还需要更多的研究来支持。

缺血性再灌注产生的氧自由基(ROS)增加，造成氧化和抗氧化失衡，从而引内源ROS产生增多，导致脂质、蛋白质及核酸等多种组织损伤[22]。而机体代谢过程中的脂质过氧化作用不仅可把ROS转化成活性化学剂，而且可通过链式或链式支链反应，放大ROS的作用。因此，ROS不但能通过生物膜中不饱和脂肪酸的过氧化，引起细胞代谢及功能障碍、损伤，甚至死亡：对蛋白质、酶的损伤，导致蛋白质变性、功能丧失和酶失活；对核酸和染色体的破坏，导致DNA链的断裂、染色体的畸变和断裂：对细胞外基质的破坏，使细胞外基质变得疏松，弹性降低，导致组织损伤，疾病的发生[23-25]。而自由基的代谢产物丙二醛(MDA)含量可反应机体内脂质过氧化的程度，间接地反映机体细胞受自由基攻击的严重程度和损伤程度。

纵览以往研究发现，有关氢的抗氧化作用，国内外研究才刚起步。研究领域仅限于临床医学实验，且多集中于诸如器官缺血再灌注损伤(I/R)[15]、减轻神经损伤[14]、抑制器官炎症反应[26]、减低药物毒性[27]，治疗小鼠基因缺陷[28]、帕金森病[29]以及人类II型糖尿病[30]等慢性氧化应激损伤与疾病。目前，研究富氢水对I/R等的作用机制缺乏深入的探讨，研究的器官组织多集中在心、肾、肺、脑、肝等。本研究采用动物实验，从肝脏缺血再灌注损伤后细胞结构与机体抗氧化两个方面探讨富氢水的作用。通过研究再灌注后肝细胞结构变化，以及通过测定ROS水平或其引起的特异性氧化产物等，探寻富氢水选择性抗氧化的在体依据，从而为进一步深入研究氢防治再灌注损伤的内在机制，为富氢水的开发利用奠定基础，也为再灌注应激损伤的防治提供新的思路，并为富氢水饮料的研发开拓新的视角、提供可行性论证与推广依据，可望对我国医学发展做出贡献。

存在问题：近几年来，人们发现氢气在疾病防治方面具有独特的发展优势，尚未发现氢气有任何毒副作用，但是，目前的研究大都集中在氢气防治疾病的表层现象，对其作用机理研究基本处于起步阶段(如氢在体内的代谢仍处于黑箱过程)，许多现象尚未完全揭示。另外，有关氢气安全、无明显毒副作用的认识，主要来自孙学军博士在潜水医学中应用高压氢气对人体无明显影响的现实依据，未见系统的生物安全性评价。这些问题有待于富氢水由实验研究向临床大宗病例应用的过程中发现。所以，氢气的人体临床应用有待臻善。我们的研究重点放在氢气保护再灌注损伤的作用机理方面。下一步需要研究长期使用富氢水的安全性或短期使用高浓度氢气对机体健康的影响。这些对于促进氢气生物效应研究尽早向临床应用转化、推动基础研究向成果传化具有重要意义。

本实验通过检测缺血60min后再灌注不同时间点大鼠血清中ALT、AST水平，进一步确定检测和取样的时间点，发现再灌注6h血清中ALT水平升高达峰值，表明缺血再灌注可造成缺血肝脏的严重损伤，该结果与既往文献报道一致[32]，HIRI早期损伤通常发生在再灌注之后0～6h，各种炎症因子显著升高，产生大量的氧自由基，肝功能损害较为明显。因而选择再灌注6h作为观察时间点，可确切反映大鼠肝脏缺血再灌注后的肝功能损伤状况。

在减轻缺血再灌注损伤的研究中，干预方式可分为预处理(Ischemic Preconditioning,IP)和后处理(Ischemic Postconditioning, IPO)[33]。二者的区别在于处理时机的不同，后处理给药时机为缺血再灌注前或再灌注即刻，其面对的是已缺血组织，是从建立一种更有效的再灌注方法出发，旨在处理和挽救缺血组织，最大程度的减轻再灌注损伤。而预处理的给药时机为缺血前，但由于临床患者缺血难以预知，实施困难，临床应用前景有限。因此与预处理相比，后处理时机易于掌握，更适于临床推广应用。目前采用后处理的方式已成为组织缺血再灌注损伤保护领域的热点。而本实验釆取预处理的方式，便于更好地造模和机理探讨。本研究采用手术前3天口服富氢水(40ml.kg-1.d-1,分两次服)。

本组实验中，缺血再灌注组ALT、AST含量较假手术组明显升高，具有统计学意义(P<0.01)，表明肝脏在缺血再灌注期间受到严重损害，存在大量肝细胞破坏，细胞内多种酶经肝窦进入血循环，与以往动物实验结果一致[32]，提示造模成功。本实验HS组ALT、AST均下降，与缺血再灌注组相比具有显著性差异(P<0.01)，提示HS对肝缺血再灌注损伤具有保护作用。

目前认为，自由基(OFR)是缺血再灌注损伤的极为重要的发病因素和环节。肝脏缺血再灌注期间，生成大量活性氧，肝实质细胞、激活的枯否细胞、中性粒细胞及内皮细胞、血小板等都可产生氧自由基[34].缺血再灌注时，肝细胞内黄嘌呤氧化酶的增多，中性粒细胞被激活后的呼吸爆发，线粒体的功能受损及儿茶酚胺的增多均可导致自由基大量生成[35]。氧自由基氧化膜磷脂中的双键不饱和脂肪酸，可引发脂质过氧化反应，导致肝细胞损伤。

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