低频电针改善SNL模型大鼠早期神经痛背根神经节辣椒素受体的机制

蒋永亮,尹小虎,沈亚芳,何晓芬,方剑乔



低频电针改善SNL模型大鼠早期神经痛背根神经节辣椒素受体的机制

蒋永亮,尹小虎,沈亚芳,何晓芬,方剑乔

(浙江中医药大学第三临床医学院,杭州 310053)

探讨低频电针干预早期神经痛背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)辣椒素受体(Transient receptor potential vanilloid type 1,TRPV1)的机制。将32只大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组与电针组,每组8只。采用脊神经结扎的方法制作大鼠神经痛模型。取患侧足三里、昆仑穴进行2 Hz电针治疗,连续3 d。检测大鼠术侧后足缩腿阈(Paw withdrawal threshold,PWT),L5DRG TRPV1表达与磷酸化水平。进一步开展PKC激动剂PMA与PKA激动剂db-cAMP拮抗2 Hz电针镇痛作用的验证性实验。SNL模型大鼠早期即出现自发性疼痛,PWT显著下降(＜0.001),L5DRG TRPV1表达水平降低(＜0.01),磷酸化水平升高(＜0.001)。SNL假手术组大鼠PWT没有显著变化。2 Hz电针能提高SNL模型大鼠的PWT(＜0.001),降低L5DRG TRPV1磷酸化水平(＜0.05)。PMA与db-cAMP足部局部注射能拮抗2 Hz电针的抗神经痛作用(＜0.001,＜0.001)。早期神经痛与损伤DRG TRPV1磷酸化水平升高有关。低频电针能改善早期神经痛,可能与下调损伤DRG的TRPV1磷酸化水平有关。

针刺疗法;电针;神经痛;脊神经结扎;TRPV1;DRG;大鼠

神经病理痛主要表现为痛觉敏化,如自发性疼痛、痛觉过敏与痛觉超敏[1],与初级痛觉神经元的超兴奋性有关[2]。多种离子通道在背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元中表达与功能的上调能引起初级痛觉神经元的超兴奋性,对神经病理痛的发生起着重要作用。辣椒素受体(Transient receptor potential vanilloid type 1,TRPV1)是TRPs超家族(一类配体门控阳离子通道)中的一员,对疼痛信号的产生、传递与调节起着重要作用[3]。研究表明初级痛觉神经元TRPV1活化能引起痛觉敏化[4-7],而其脱敏疗法对多种神经痛有效[8],说明初级痛觉神经元TRPV1在神经病理痛中起着重要作用。本实验探讨DRG神经元TRPV1参与早期神经痛的活化形式,以及低频电针对其的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用32只清洁级健康雄性SD大鼠,体重为(200±10)g,购自中国科学院上海实验动物中心[SCXK(沪) 2008-0016],由浙江中医药大学实验动物中心饲养。饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲养与自由饮水。

1.2 实验仪器及试剂

0.25 mm×13 mm无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司);HANS-200A穴位神经刺激仪(联创科技南京济生医疗科技有限公司);动态足底测量仪(意大利UGO Basile公司);凝胶成像仪(日本Fujifilm公司);蛋白酶抑制剂Cocktail(生工上海股份有限公司); RIPA裂解液(江苏碧云天公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司);绵羊抗大鼠TRPV1多克隆抗体(美国Abcam公司);兔抗大鼠磷酸化TRPV1多克隆抗体(台湾Abnova公司);小鼠单克隆抗体b-actin抗体(上海康成生物工程有限公司);超敏ECL化学发光试剂盒(江苏碧云天公司);PKA激动剂db-cAMP(美国Sigma公司);PKC激动剂PMA(美国Sigma公司)。

1.3 分组与造模

采用完全随机法将大鼠随机分为4组,分别为正常组、假手术组、模型组与低频电针组,每组8只。按照前期右侧L5脊神经结扎(spinal nerve ligation, SNL)的方法建立神经病理痛模型[9]。大鼠称重后,用10% 水合氯醛3.5 mL/kg腹腔麻醉,大鼠呈俯卧位放置于手术台上,腰部去毛,在脊柱右侧旁开0.5 cm处沿L3-S2垂直切开皮肤,钝性分离右侧椎旁肌肉,小心咬除L5横突,暴露、分离L5脊神经,用5/0丝线结扎,缝合切口,肌注青霉素预防感染。假手术组操作同模型组,但不结扎神经。

1.4 电针治疗

造模后1 d开始电针治疗,选取术侧足三里、昆仑穴(取穴参照华兴邦大鼠穴位图谱),连接韩氏穴位神经刺激仪,刺激参数为2 Hz,1 mA、2 mA先后各15 min,连续治疗3 d。正常组、模型组、假手术组大鼠不做治疗,给予低频电针组相同固定。

1.5 痛觉超敏反应检测

采用动态足底测量仪检测大鼠术侧后足缩腿阈(Paw withdrawal threshold,PWT),评价大鼠机械痛觉超敏反应。测量前,将大鼠适应环境30 min。待大鼠安静后,将连于机械泵上的类Von Frey丝的金属丝(0.5 mm)置于大鼠右后足中央,避开足垫;启动机械泵,金属丝即以恒定速度自动上台,对大鼠足底施加机械刺激。刺激力量从0 g开始以2.5 g/s递增,直至大鼠产生缩腿反应;最大刺激力量为50 g,以免大鼠足爪受损;连续测量3次,取其平均值,每次间隔5 min。分别于造模前及造模后第1、2、3天测量PWT。

1.6 Western blotting检测DRG TRPV1表达与p-TRPV1水平

造模后第3天将大鼠用10%水合氯醛腹腔注射(3.5 mL/kg)麻醉,剪开胸腔,暴露心脏。将灌注针头从心尖直接刺入主动脉,剪开右心耳,进行生理盐水灌注,迅速取出术侧L4-6DRG,﹣80℃冰箱保存。采用RIPA裂解液结合超声粉碎法抽提蛋白。总蛋白上样量为30mg,电泳浓缩胶电压为80 v,30 min,分离胶电压为120 v,90 min;转膜用0.45mm PVDF膜,90 min;在5%脱脂奶粉中封闭2 h;一抗孵育分别用绵羊抗大鼠TRPV1多克隆抗体(1:2000)、兔抗大鼠p-TRPV1单克隆抗体(1:1000)、小鼠抗大鼠b-actin单克隆抗体(1:10,000),在4℃孵育过夜。TBST缓冲液洗涤后,辣根过氧化物酶(HRP)结合二抗孵育2 h;用ECL试剂盒进行显色反应,用凝胶成像仪摄像,用Image Quant TL软件进行蛋白条带灰度分析。

1.7 激动剂验证实验

将大鼠随机分为生理盐水注射对照组(EA＋Saline)、PKC激动剂PMA注射组(EA＋PMA)与PKA激动剂db-cAMP注射组(EA＋db－cAMP),每组8只。造模、电针治疗同上。在造模后第3天于电针治疗前10 min分别足背注射生理盐水、100mg db-cAMP、1mg PMA。db-cAMP、PMA参照说明书先分别用纯水、二甲基亚砜微量溶解,再用saline补足到50mL进行注射。分别于造模前及造模后第1、3天测量PWT。

1.8 统计学方法

分析采用SPSS16.0,实验数据用均数±标准误表达,多组间比较采用单因素方差分析(-),组间两两比较采用检验。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 2 Hz电针对SNL模型大鼠早期术侧PWT的影响

表1 各组大鼠不同时间点术侧PWT比较 (±s,g)

注:与正常组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

与正常组比较,SNL模型组大鼠早期出现舔足、抬足等自发性疼痛现象,术侧PWT显著降低(＜0.001), SNL假手术组没有显著变化;电针组大鼠造模后PWT与正常组比较,差异具有统计学意义(＜0.01);电针组大鼠治疗后PWT与模型组比较,差异具有统计学意义(＜0.001)。详见表1。

2.2 2 Hz电针对SNL模型大鼠早期术侧L5 DRG TRPV1表达的影响

与正常组比较,SNL模型组大鼠第3天术侧L5DRG TRPV1表达显著降低(＜0.01);2 Hz电针对SNL大鼠术侧L5 DRG TRPV1表达没有显著影响(＞0.05)。详见图1。

注:与正常组比较1)P＜0.01

2.3 2 Hz电针对SNL模型大鼠早期术侧L5 DRG TRPV1磷酸化水平的影响

与正常组比较,SNL模型组大鼠第3天术侧L5DRG p-TRPV1水平显著升高(＜0.001);2 Hz电针能显著降低SNL大鼠术侧L5 DRG升高的p-TRPV1水平(＜0.05)。详见图2。

注:与正常组比较***P＜0.01;与SNL组比较#P＜0.05

2.4 PKC、PKA激动剂对2 Hz电针抗神经痛作用的影响

PKC激动剂PMA、PKA激动剂db-cAMP能显著拮抗2 Hz电针抗SNL神经痛的作用(＜0.001,＜0.001)。详见表2。

表2 PMA、db-cAMP对2 Hz电针抗神经痛作用的影响 (±s,g)

注:与生理盐水注射对照组比较1)＜0.01

3 讨论

本实验结果表明,在神经痛早期损伤DRG TRPV1通过磷酸化形式活化,而非通过表达增强。2 Hz低频电针能有效干预TRPV1磷酸化水平发挥对早期神经痛的治疗作用。

TRPV1在外周主要分布在较细的DRG神经元、C纤维和Ad纤维[8],参与疼痛信号的产生、传递与调节。研究表明DRG TRPV1激活能诱导大鼠三叉神经痛[10],而对其的脱敏疗法能有效减轻多种神经痛[8],说明DRG TRPV1活化对神经痛的发生起着重要作用。有报道, TRPV1功能上调参与炎症痛痛敏化的发生,而其表达上调参与炎症痛痛敏化的维持[11]。对于早期神经痛DRG TRPV1通过何种途径活化(功能上调还是表达上调)参与痛敏化过程尚未清楚。

本实验结果显示,SNL模型大鼠早期就出现舔足、抬足等自发性痛觉疼痛现象与机械性痛觉超敏反应,其损伤DRG的TRPV1磷酸化水平上升,而表达下降。神经损伤或病变时,蛋白激酶PKC、cAMP依赖的PKA被激活,磷酸化TRPV1,使TRPV1功能上调,引起痛觉敏化[5-6]。损伤DRG TRPV1磷酸化水平升高引起的TRPV1功能上调可能在SNL神经痛早期中起着重要作用。

低频电针对神经痛有显著的镇痛效应[12-13],且不被纳洛酮阻断[14],表明电针对神经痛的干预存在非阿片机制。本实验结果也证实2 Hz低频电针能有效减轻SNL模型大鼠早期的机械性痛觉超敏。笔者之前的研究表明2 Hz低频电针也能减轻SNL模型大鼠维持期(SNL造模后第15天)的机械性痛觉超敏[9]。其他研究也表明低频电针对糖尿病外周神经痛、神经营养因子注射诱导的神经痛以及癌性痛均有镇痛作用[15-17]。这些表明低频电针对神经痛有明确的治疗作用。2 Hz低频电针能降低SNL模型大鼠早期神经痛损伤DRG的TRPV1磷酸化水平,考虑到神经损伤或病变时,蛋白激酶PKC、PKA被激活,能通过磷酸化TRPV1增强初级痛觉神经元的兴奋性,进而导致痛觉敏化[5-6],笔者进一步采用PKC激动剂PMA与PKA激动剂db-cAMP足部局部注射观察对2 Hz低频电针镇痛作用的影响。笔者发现PMA、db-cAMP能拮抗2 Hz低频电针抗SNL早期神经痛的作用。这些说明,在神经痛早期,2 Hz低频电针改善痛觉敏化可能与下调DRG TRPV1磷酸化水平有关。笔者之前的研究表明,在神经痛的维持期,2 Hz低频电针对TRPV1也有一定的调节作用,能下调邻近未损伤DRG的TRPV1表达水平。

综上所述,本实验研究结果表明,SNL神经痛早期痛觉敏化与DRG TRPV1磷酸化水平升高有关。低频电针能改善早期神经痛,可能与下调损伤DRG的TRPV1磷酸化水平有关。电针疗法在神经痛的治疗上具有广阔的应用前景。

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Dorsal Root Ganglion Capsaicin Receptor-involved Mechanism of Low-frequency Electroacupuncture in Alleviating Early Neuropathic Pain in a Rat Model of SNL

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,310053,

To investigate the dorsal root ganglion (DRG) capsaicin receptor (transient receptor potential vanilloid type 1, TRPV1)-involved mechanism of low-frequency electroacupuncture in alleviating early neuropathic pain.Thirty-two rats were randomly allocated to normal, sham operation, model and electroacupuncture groups, 8 rats each. A rat model of neuropathic pain was made by spinal nerve ligation. Points Zusanli and Kunlun on the affected side were selected for three consecutive days of treatment with 2 Hz electroacupuncture. Operated side hind paw withdrawal threshold (PWT), and L5DRG TRPV1 expression and phosphorylation levels were measured in the rats. The antagonistic effects of PKC agonist PMA and PKA agonist db-cAMP on 2 Hz electroacupuncture analgesia were further validated.Spontaneous pain occurred in the early stage, and PWT lowered markedly (＜0.001), L5DRG TRPV1 expression levels fell (＜0.01) and L5DRG TRPV1 phosphorylation levels rose (＜0.001) in a rat model of SNL. PWT did not change in the sham SNL group of rats. 2 Hz electroacupuncture raised PWT (＜0.001) and lowered L5DRG TRPV1 phosphorylation levels (＜0.05) in a rat model of SNL. Local injection of the foot with PMA and db-cAMP inhibited the alleviating effect of 2 Hz electroacupuncture on neuropathic pain (＜0.001,＜0.001).Early neuropathic pain is related to a rise in TRPV1 phosphorylation levels in the injured DRG. Low-frequency electroacupuncture can relieve early neuropathic pain, which may be related to the down-regulation of TRPV1 phosphorylation levels in the injured DRG.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Neuropathic pain; Spinal nerve ligation; TRPV1; DRG; Rats

1005-0957(2014)05-0476-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.05.0476

2014-01-07

国家自然科学基金资助项目(81072855,81303039);浙江省自然科学基金资助项目(LY12H27015,Z2100979);国家中医药管理局重点学科(针灸学)

蒋永亮(1981 - ),男,助理研究员

方剑乔(1961 - ),男,教授,Email:fangjianqiao7532@163. com