鼠神经生长因子对丁胺卡那霉素耳毒性的保护作用

蔡琴芳 蒋立新

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是神经营养因子中最早被发现的成员，对神经系统的发育、正常生理功能的维持及损伤后的修复有重要意义[1]。据报道，从小鼠颌下腺中提取的鼠神经生长因子在临床主要应用于各类神经损伤的修复[2]，NGF对噪声性聋有一定临床疗效[3]。本实验旨在通过给豚鼠腹腔注射丁胺卡那霉素(amikacin，AK)创建耳毒性动物模型，同时肌肉注射NGF，采用ABR检测和耳蜗基底膜铺片观察及毛细胞计数来探讨NGF对丁胺卡那霉素所致听力损伤的保护作用，报告如下。

1 材料与方法

1.1动物分组及给药方法 取耳廓反射灵敏、健康雄性白色红目豚鼠45只,体重350～400 g(广东省动物中心提供)，随机分成对照组、中毒组、治疗组三组，每组15只。对照组不予药物处理；中毒组腹腔注射丁胺卡那霉素(金陵药业股份有限公司，生产批号：080801)400 mg·kg-1·d-1，连续10天；治疗组同法给予丁胺卡那霉素的同时肌肉注射鼠神经生长因子(厦门北大之路生物工程有限公司，生产批号20050901)1 500 AU·kg-1·d-1，连续14天。

1.2ABR测试 分别于给药前1天、给药结束后第10、20天行ABR测试。豚鼠1%戊巴比妥钠30 mg/kg 腹腔注射麻醉后行ABR测试。诱发电位仪型号：MEB-5304K(日本光电公司)，记录电极置于颅顶部，参考电极和接地电极分别置于同侧乳突部和鼻尖。耳机距豚鼠外耳道约0.5 cm, 采用频率为11次/秒的短声刺激，带通滤波30～3 000 Hz，叠加512次，扫描时程10 ms。以波Ⅲ刚刚出现时的刺激声强度作为ABR反应阈值。

1.3改良耳蜗基底膜硝酸银染色铺片与方法 最后一次ABR测试结束后处死所有豚鼠并取出听泡，行基底膜硝酸银染色铺片观察。与常规耳蜗基底膜硝酸银染色铺片法[4]相比，本实验在曝光显色和基底膜剥离上进一步改良，铺片效果满意。暴露耳蜗后细针挑开蜗顶和圆窗膜并去除镫骨，经蜗顶小孔灌注0.5%硝酸银溶液，蒸馏水冲洗及10%中性福尔马林灌注固定后将耳蜗浸入10% 中性福尔马林中，放入4 ℃冰箱内继续固定4小时。用小尖镊取出附有完整基底膜的蜗轴，放入盛有10%中性福尔马林固定液的玻璃器皿中，置放于100 W的白炽灯下，待标本变为棕褐色后取下完整的基底膜，甘油封片，高倍显微镜下观察并摄片。在显微镜400倍视野下,计算基底膜各回毛细胞缺失百分率，以表皮板轮廓及纤毛消失作为毛细胞的缺失标志。

2 结果

2.1各组豚鼠用药前后ABR反应阈变化 给药前三组豚鼠间ABR反应阈差异无统计学意义(P>0.05)，给药结束后第10天及20天中毒组及治疗组ABR反应阈均高于对照组，但治疗组ABR阈值低于中毒组(P<0.05)。对照组在3个时间点上的ABR阈值差异无统计学意义(P>0.05)，治疗组及中毒组第10天ABR阈值均较给药前升高(P<0.05)，但给药结束后第20天与第10天ABR阈值差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 三组豚鼠用药前后ABR阈值

注：*与对照组比较，P<0.05；#与中毒组比较，P<0.05；△与同组给药前比较，P<0.05

2.2耳蜗基底膜硝酸银染色铺片观察及毛细胞计数结果 对照组耳蜗基底膜可见3排OHC和1排IHC排列整齐，OHC听纤毛成V字形，IHC听纤毛成一字型，偶有个别缺失(图1a)；中毒组OHC缺失较多，从顶回至底回OHC损伤程度逐渐加重，且各回毛细胞均以第1排和第2排损伤为重，IHC个别缺失(图1b)；治疗组OHC散在缺失，IHC排列较整齐，少有缺失(图1c)。中毒组及治疗组各回毛细胞缺失率均高于对照组(P<0.05)，中毒组耳蜗基底膜除第四回外，其他各回毛细胞的缺失率均高于治疗组(P<0.05)。对照组基底膜各回毛细胞缺失率差异无统计学意义(P<0.05)，中毒组及治疗组均以第一回毛细胞损伤最严重(P<0.05)(表2)。

图1 三组豚鼠耳蜗基底膜铺片图(硝酸银染色×400)

表2 三组豚鼠耳蜗各回毛细胞缺失率

注：*与对照组比较，P<0.05；#与中毒组比较，P<0.05

3 讨论

丁胺卡那霉素(AK)的耳毒性机制目前尚不完全明确。研究表明，AK与毛细胞膜上的磷酸肌醇酯结合后破坏细胞膜的通透性并进入细胞内[5]，特异性结合线粒体内核糖体亚基引起线粒体功能障碍，致使能量代谢及蛋白质合成障碍，导致大量自由基生成并进一步损伤线粒体，引起细胞凋亡[6]。因毛细胞凋亡和神经突触损伤，螺旋神经元丧失了必要的信号刺激和神经营养因子而发生延迟性死亡，导致听功能进一步损伤。本实验结果显示，中毒组动物腹腔注射AK 10天后，ABR反应阈较正常对照组明显升高，基底膜硝酸银染色铺片显示耳蜗毛细胞形态学变化与ABR阈移变化一致，毛细胞缺失率明显高于正常对照组，说明AK耳毒性造模成功。

神经生长因子为一个118个氨基酸的多肽分子，通过与低亲和性受体p75及高亲和性受体TrkA结合而发挥作用。NGF及其受体对听觉系统的作用多年来一直受到重视，众多学者对其进行了大量实验研究[7]，国外研究发现NGF及其受体在内耳发育、成熟的各个阶段皆有不同程度的表达[8]，可见NGF对内耳正常发育及成熟后正常生理功能的维持可能具有重要作用。为进一步明确NGF对听觉系统的作用，Sobkowicz等[9]利用一种特殊的小鼠(Bronx waltzer deaf mouse)研究其在听觉传入系统突触发生过程中的作用，发现这种小鼠因5 号染色体上存在基因突变而表现出一种非常典型的特征：在传入神经与感觉上皮发生突触联系的阶段，特别是在产前两天到产后第三天，传入神经的突触形成失败，大量内毛细胞开始变性死亡。而在培养基中加入NGF后，内毛细胞与神经末梢形成了稳定的突触链接。该实验证明NGF可以单独诱导此过程，并且在突触形成后维持持其正常功能。还有学者[10]将小鼠胚胎背根神经节移植到成熟大鼠耳蜗鼓阶后，分别蜗内灌注NGF和人工淋巴液，观察到NGF组与人工淋巴液组其发育表现有很大差别，在NGF组可见大量神经突起从背根神经节伸出，穿过骨螺旋板靠近螺旋神经节及螺旋器，说明NGF对神经突起的形成及定向生长有重要意义。

本实验结果显示，治疗组注射NGF后，耳蜗基底膜铺片显示毛细胞损伤较轻，毛细胞缺失率小于中毒组，且ABR反应阈较中毒组明显降低，说明NGF对丁胺卡那霉素所致耳蜗毛细胞损伤及听损伤有保护作用，其机制可能与NGF可促进耳蜗神经轴突再生、营养螺旋神经元、保护并修复神经突触有关。另外，近年来发现NGF可以通过调节血管内皮细胞生长因子表达或直接促进周围再生神经营养及血管形成[11]。所以NGF也可能通过促进耳蜗微血管损伤修复和血管生成，增加柯替器血供，改善耳蜗微循环，促进代谢及氧自由基等有害物质排泄，从而减轻毛细胞的损伤并促进修复。

听觉系统损伤后的修复治疗一直是耳科学及听力学研究领域的前沿课题之一，本实验通过观察神经生长因子对丁胺卡那霉素所致豚鼠听损伤的保护作用，为防治氨基糖苷类抗生素耳毒性和临床治疗感音神经性聋提供了可靠的实验依据。

4 参考文献

1 Levi-Montalcini R, Skaper SD, Dal Toso R, et al. Nerve growth factor: from neurotrophin to neurokine[J]. Trends Neurosci, 1996，19:514.

2 王英超, 孙红梅, 董振香. 注射用鼠神经生长因子[J]. 中国新药杂志, 2007, 16:1538.

3 吴萍,王黎,周枫,等. 神经生长因子治疗职业性听力损伤的临床研究[J]. 中国工业医学杂志, 2007, 20:283.

4 丁大连,郭毓卿,罗德峰,等.豚鼠全内耳终器硝酸银染色法[J].上海第二医科大学学报,1989, 9:326.

5 Schacht J. Biochemical basis of aminoglycoside ototoxicity[J]. Otolaryngol Clin North Am, 1993, 26:845.

6 丁大连, Salvi R. 氨基糖苷类抗生素耳毒性研究[J]. 中华耳科学杂志, 2007, 5:1251.

7 蔡琴芳, 蒋立新. 神经生长因子与听觉系统[J]. 国际耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2009, 6: 343.

8 Dai CF, Steyger PS, Wang ZM, et al. Expression of Trk A receptors in the mammalian inner ear[J]. Hearing Research, 2004, 187: 1.

9 Sobkowicz HM, August BK, Slapnick SM. Influence of neurotrophins on the synaptogenesis of inner hair cells in the deaf Bronx waltzer (bv) mouse organ of Corti in culture[J]. International Journal Of Developmental Neuroscience, 2002, 20: 537.

10 Hu Z， Ulfendahl M, Olivius NP. NGF stimulates extensive neurite outgrowth from implanted dorsal root ganglion neurons following transplantation into the adult rat inner ear[J]. Neurobiology Of Disease, 2005, 18：184.

11 Julio-Pieper M, Lara HE, Bravo JA, et al. Effects of nerve growth factor (NGF) on blood vessels area and expression of the angiogenic factors VEGF and TGFbeta1 in the rat ovary[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2006, 10: 57.