艾灸生成物对大鼠脑神经系统形态学的影响

周次利,吴璐一,窦传字,刘慧荣,冯辉,崔云华,马晓芃,赵琛,吴焕淦

(1.上海市针灸经络研究所,上海 200030;2.上海中医药研究院,上海 201203)

艾灸生成物对大鼠脑神经系统形态学的影响

周次利1,吴璐一2,窦传字1,刘慧荣1,冯辉2,崔云华1,马晓芃1,赵琛2,吴焕淦1

(1.上海市针灸经络研究所,上海 200030;2.上海中医药研究院,上海 201203)

目的 观察不同浓度艾灸生成物对SD大鼠脑神经系统形态学的影响。方法 将40只大鼠随机分为正常对照组、低剂量艾灸生成物组、中剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物恢复组。低剂量艾灸生成物组、中剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物组,艾灸生成物与纯净气的浓度比分别为 0.4：2.0、0.8：2.0、1.6：2.0,每天暴露 4 h,每星期5次,持续60 d;高剂量艾灸生成物恢复组经60 d高剂量艾灸生成物刺激后,在空气中自然暴露21 d作为恢复期。正常对照组大鼠不进行任何艾灸生成物干预,常规饲养 60 d。光学显微镜下观察各组大鼠大脑皮层、海马、小脑病理形态,透射电镜下观察海马超微形态。结果 各组大鼠大脑皮层、海马、小脑细胞病理形态无明显差异,海马超微结构形态无明显差异。结论 艾灸生成物对大鼠脑神经系统形态无明显影响。

艾灸生成物;安全性;脑神经系统;形态学;大鼠

灸法最早记载于《左传》,至今已有数千年的历史,是一种传统的中医治疗方法。灸法以艾为主要施灸材料,施灸过程中产生艾烟等艾灸生成物。自古就有运用艾叶烟熏治疗和预防疾病的记载[1-2]。近年来,随着人们环保及健康安全意识的提高,艾烟等艾灸生成物的安全性逐渐成为灸法研究中亟待解决的热点问题[3]。本研究观察不同浓度艾灸生成物对SD大鼠脑神经系统的形态学影响,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠40只,雄性,由复旦大学上海医学院实验动物科学部提供,体重为(160±20)g。

1.2 主要试剂与仪器

艾条(南阳市卧龙汉医艾绒厂),HOPE-MED8053B燃烟动式基础染毒设备(天津合普公司),8050-1型动静洗三合一染毒柜(天津合普公司),组织包埋机(LEICA),石蜡切片机(LEICA公),LKB-Ⅰ型超薄切片机(LEICA),医用冷藏箱(海尔),OLYMPUS BX53显微镜(OLYMPUS),OLYMPUS cellSens Dimension图像分析系统(OLYMPUS),PHILIPS CM-120透射电镜(PHILIP)。

1.3 分组

40只大鼠随机分为5组,即正常对照组、低剂量艾灸生成物组、中剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物恢复组,每组8只。

1.4 艾灸生成物干预

艾条以3：1出品率的1级精制3年陈艾绒作为原材料,参照卫生部清艾条制作标准(中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十七册)制成,每根艾条重25 g,长20 cm,直径2 cm,以桑皮纸包裹,由南阳市卧龙汉医艾绒厂提供。

在HOPE-MED8053B燃烟动式基础染毒设备中点燃艾条,通过调节混合气(艾灸生成物)与纯净气的浓度比,控制不同组别大鼠的艾灸生成物刺激浓度。低剂量艾灸生成物组、中剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物组,混合气与纯净气的浓度比分别为 0.4：2.0、0.8：2.0、1.6：2.0。

低剂量艾灸生成物组、中剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物恢复组大鼠分别置于8050-1型动静洗三合一染毒柜中,按不同浓度每天暴露4 h,每星期5 次,持续60 d;高剂量艾灸生成物恢复组经60 d高剂量艾灸生成物刺激后,在空气中自然暴露21 d作为恢复期。正常对照组大鼠不进行任何艾灸生成物干预,常规饲养。

企业也可以只针对一种产品进行调查，考察顾客满意度的变化指数，这就是顾客满意度。利用让渡价值公式计算顾客满意度；当顾客满意度小于0时，表明顾客不满意；顾客满意度大于0时，表明顾客满意；如果两者的差值太大，就表示顾客非常满意。企业可以根据上述的公式，定期做一些市场推广和调查问卷，通过对顾客的满意度调查调整公司的服务。在市场营销时可以根据顾客对购买商品的要求，提供相应的服务。如果顾客买到满意的产品，就会表现与购买前不一样的状态。企业也可以从不同的角度去观察顾客在购买产品的服务过程是否达到预期的效果，分析出他们所需要的产品和服务[4]。

1.5 取材与指标检测

60 d艾灸生成物干预结束后,正常对照组、低剂量艾灸生成物组、中剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物组大鼠称重,按体重以 3%戊巴比妥钠 0.1 mL/ 100 g足量麻醉大鼠,断头取脑,迅速分离大脑皮层、海马、小脑。左侧海马、大脑皮层、小脑置于4%多聚甲醛溶液后固定不超过24 h,石蜡包埋、切片,备用。右侧海马置于2.5%戊二醛中,备用。

21 d恢复期结束后,高剂量艾灸生成物恢复组按上述方法同样取材。

1.5.1 光学显微镜观察

HE染色行大鼠脑组织光学显微镜观察,步骤如下。

切片常规脱蜡至水,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20 min,100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5 min;双蒸水5 min×2;苏木素3 min;自来水冲洗10 min;盐酸乙醇3 s;流水10 min;伊红1 min。梯度乙醇上行脱水,70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇各30 s。二甲苯透明,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20 min;中性树胶封片,光学显微镜下观察大鼠脑组织,拍片。

1.5.2 透射电镜观察

将固定好的标本用 0.1 M磷酸漂洗液漂洗15 min×3,1%饿酸固定液固定2～3 h,0.1 M磷酸漂洗液漂洗15 min×3。4℃冰箱内50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇90%丙酮(1：1)、90%丙酮各15～20 min脱水后,室温100%丙酮脱水15～20 min×3。室温纯丙酮＋包埋液(2：1)浸透3～4 h后,室温纯丙酮＋包埋液(1：2)过夜,37℃纯包埋液浸透2～3 h。37℃过夜、45℃12 h、60℃24 h以固化标本。切片,3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色,PHILIPS CM-120透射电镜观察,拍片。

2 结果

2.1 各组大鼠脑组织病理形态学变化

如图 1所示,正常对照组大鼠大脑皮层层次结构清晰,锥体细胞、颗粒细胞、梭形细胞等神经元清晰可见,结构完整,排列整齐,层次紧密,轮廓清晰,染色均匀,未见神经元变性、坏死。低剂量艾灸生成物组、中剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物恢复组大鼠大脑皮层病理形态未见明显异常。

图1 各组大鼠大脑皮层病理形态学变化(标尺=20 µm)

如图2所示,正常对照组大鼠海马层次结构清晰,锥体细胞、颗粒细胞等神经元清晰可见,结构完整,排列整齐,层次紧密,轮廓清晰,染色均匀,未见神经元变性、坏死。低剂量艾灸生成物组、中剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物恢复组大鼠海马病理形态未见明显异常。

图2 各组大鼠海马病理形态学变化(标尺=20 µm)

如图3所示,正常对照组大鼠小脑层次结构清晰,颗粒细胞、浦肯野细胞等神经元清晰可见,结构完整,排列整齐,层次紧密,轮廓清晰,染色均匀,未见神经元变性、坏死。低剂量艾灸生成物组、中剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物恢复组大鼠小脑病理形态未见明显异常。

图3 各组大鼠小脑病理形态学变化(标尺=20 µm)

2.2 透射电镜观察

如图4所示,正常对照组大鼠海马神经元核圆,染色质浅,核仁与核膜孔明显可见,细胞质线粒体数量不多,卵圆形或短管状,板层嵴粗面内质网与游离核糖体丰富,高尔基器位于核周,有少量脂褐素,微管和神经丝可辨。低剂量艾灸生成物组、中剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物组、高剂量艾灸生成物恢复组大鼠海马超微结构形态未见明显异常。

图4 各组大鼠海马超微结构形态学变化(标尺=1 µm)

3 讨论

艾烟等艾灸生成物的安全性评价是近年来灸法研究的热点。艾烟等艾灸生成物是否对机体与环境产生不良影响是影响灸法发展的重要因素。化学研究显示,艾烟中既含有对人体有益的成分,亦含有可能对人体不利的成分[4]。Wheeler等[5]报道,在正常条件下,艾烟挥发性物质和CO含量均不会导致安全危害;艾烟的检测结果与城市环境中报告结果基本水平相当;极端情况下,艾条燃烧产生的艾烟中,只有丙烯醛、对苯二酚2种挥发性物质水平和CO水平等于或大于安全接触水平。黄茶熙等[6]监测并分析京津地区夏季艾灸诊室和灸疗馆内可吸入颗粒物(PM10),显示京津地区艾灸场所内存在以艾燃烧生成物为主要来源的可吸入颗粒物(PM10)污染,艾灸场所内PM10的平均质量浓度(3.54 mg/m3)超过医院候诊室卫生标准(GB9671-1996)中规定的最高限值(0.15 mg/m3),同时也超过同时间段北京市和天津市大气PM10质量浓度的月平均值(0.92 mg/m3和0.83 mg/m3)。目前,尚未见大样本的艾灸生成物流行病学调查研究报告。Park等[7]检索Web of Science、Cochrane Central Register of Controlled Trials等14个数据库相关文献,系统评价艾灸的不良事件,显示艾烟可引起少数有慢性咽炎病史的患者对艾灸烟雾过敏发生咳嗽,通风后改善;少数患者发生艾灸过敏,停灸或抗过敏治疗后过敏症状、体征消失。兰蕾等[8]以SD大鼠为试验对象,进行艾烟的急性毒理试验,结果表明艾烟对大鼠的半数致死浓度LC50为11117 mg/m3,根据世界卫生组织(WHO)的标准得出艾烟的毒性分级为微毒。

新近研究表明艾烟具有一定机体保护作用和细胞毒作用。一定浓度和时间的艾烟可提高快速老化小鼠血清及大脑抗氧化能力,减少自由基代谢产物,增强自由基清除能力,从而起到显著的抗衰老作用[9-10]。艾烟和/或艾燃烧灰烬水提取物可选择性对肿瘤细胞产生细胞毒作用,抑制鼠巨噬细胞样细胞Raw264.7一氧化氮和诱导型一氧化氮合酶表达,具有抗癌和抗炎潜力,可成为治疗肿瘤和炎症的新型佐剂[11-16]。刘平等[17]报道不同浓度艾烟干预6个月(20 min/d)对大鼠外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞及CD3+CD4+/CD3+CD8+无影响,但可下调CD4+T细胞中CD4+CD25+Treg细胞的比例,艾烟预处理可能通过该途径发挥对机体的免疫调节作用,增强机体抗肿瘤作用。胡海等[18-19]报道艾烟冷凝物对肺泡Ⅱ型上皮细胞A549形态、数量、活性及凋亡呈浓度依赖性或时间浓度依赖性,0.12 g/L浓度的艾烟冷凝物作用于肺泡Ⅱ型上皮细胞A549 12 h后可显著提高细胞存活率。韩丽等[20]研究显示艾烟冷凝物具有潜在的遗传毒性,尚未发现剂量效应关系。可见,艾烟等艾灸生成物对机体作用的安全性与刺激浓度、刺激时间有一定相关性。

脑是机体重要的生命中枢。大脑皮层、海马、小脑与机体学习和语言等高级认知功能,躯体感觉,听觉,嗅觉,视觉,记忆,情感,运动控制等密切相关。崔莹雪等[21]报道艾烟可影响快速老化模型小鼠脑内氨基酸类神经递质谷氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸表达,认为艾烟可通过调整脑内氨基酸的异常代谢达到抗衰老的效应。本研究中,我们采用透射电镜观察各组大鼠海马超微形态,光学显微镜观察大脑皮层、海马、小脑形态,探讨不同浓度艾灸生成物对SD大鼠脑神经系统形态学的影响。结果表明各组大鼠海马超微结构形态无明显差异,大脑皮层、海马、小脑细胞病理形态无明显差异,显示本研究艾灸生成物浓度与干预时间对大鼠脑神经系统形态无明显影响。兰蕾等[22]研究结果亦显示不同浓度艾烟对大鼠脑组织形态无明显毒性作用,与本研究结果一致。

今后的研究中,可进一步探讨艾灸生成物不同刺激方式对机体各器官、组织、细胞、蛋白、基因、代谢产物等的结构和功能的影响,开展艾灸生成物接触者流行病学调查,从而获取艾灸生成物安全性范围,制定艾灸生成物安全性评价标准,促进灸法的临床应用与推广,推动灸法的传承与创新。

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Effect of Moxibustion-produced Substances on the Morphology of the Nervous System in Rat Brain

ZHOU Ci-li1, WU Lu-yi2,DOU Chuan-zi1, LIU Hui-rong1, FENG Hui2, CUI Yun-hua1, MA Xiao-peng1, ZHAO Chen2, WU Huan-gan1.
1.Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian,Shanghai 200030,China; 2.Shanghai Academy o f Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China

O bjective To i nvestigate th e e ffects o f d ifferent c oncentrations o f m oxibustion-produced s ubstances on the m orphology of t he nervous system in S D r at brain.MethodForty r ats w ere r andomly al located t o normal c ontrol, low-dose moxibustion-producedsubstances,middle-dose moxibustion-produced substances,high-dose moxibustion-produced substances and high-dose moxibustion-produced substances restoration groups. The concentration ratio of moxibustion-produced substances to pure air was 0.4:2.0 in t he l ow-dose m oxibustion-produced s ubstances g roup, 0.8:2.0 in th e m iddle-dose m oxibustionproduced substances group and 1.6:2.0 in the high-dose moxibustion-produced substances group. These three groups were exposed 4 hrs daily, 5 times a week, for 60 consecutive days. The high-dose moxibustion-produced substances restoration group was stimulated with high-dose moxibustion-produced substances for 60 days and then exposed to air for 21 days as a restoration stage. The normal control group of rats was not treated with any moxibustion-produced substances and routinely fed for 60 days. The pathological forms o f cer ebral co rtex, hippocampi and cerebella were obs erved by opt ical m icroscopy a nd hippocampal ultrastructures, by transmission e lectron microscopy in e very g roup of r ats.ResultThere were n o s tatistically s ignificant d ifferences i n t he pathological forms of cerebral cortex, hippocampi and cerebella, and hippocampal ultrastructures between various groups of rats.ConclusionMoxibustion-produced substances have no marked effect on the morphology of the nervous system in rat brain.

Moxibustion-produced substances; Safety; The nervous system in the brain; Morphology; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.06.0495

1005-0957(2014)06-0495-04

2014-01-15

国家自然科学基金项目(81102637);上海高校青年教师培养资助计划项目(SZY11067);国家重点基础研究发展计划项目(2009CB522900)

周次利(1980 - ),女,助理研究员,博士,研究方向为艾及艾灸生成物安全性评价与针灸治疗胃肠疾病的临床与基础研究,E-mail： zhoucili2010@126.com

赵琛(1973 - ),女,主任医师,E-mail：chris_0127@126.com