真武汤对单侧输尿管梗阻模型大鼠整合素连接激酶和血管紧张素Ⅱ的干预研究

周波宋立群，贠捷，张丹萍，宋业旭，马艳春，陈方明

（1.四川达州市中西医结合医院肾内科，635002；2.黑龙江中医药大学附属第一医院；3.黑龙江省中医药大学；4.四川省达州市畜禽繁育改良站）

真武汤对单侧输尿管梗阻模型大鼠整合素连接激酶和血管紧张素Ⅱ的干预研究

周波1宋立群2，贠捷3，张丹萍4，宋业旭3，马艳春3，陈方明1

（1.四川达州市中西医结合医院肾内科，635002；2.黑龙江中医药大学附属第一医院；3.黑龙江省中医药大学；4.四川省达州市畜禽繁育改良站）

目的研究整合素连接激酶（ILK）和血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）在UUO大鼠模型的表达及真武汤对肾间质纤维化（RIF）的干预作用。方法采用单侧输尿管梗阻（UUO）方法复制大鼠肾间质纤维化模型，随机分为假手术组和造模组，造模组分为模型组、真武汤低剂量组、中剂量组、高剂量组和尿毒清对照组五组；分别给予相应药物灌服，术后2、3和4周分批取材，收集其尿液、血清，生化法检测24 h尿蛋白定量，ELISA法检测ILK和Ang-Ⅱ的蛋白表达。结果真武汤能够降低UUO大鼠模型血清中ILK和Ang-Ⅱ蛋白含量，具有统计学意义，真武汤中剂量组ILK和Ang-Ⅱ的含量蛋白最低。结论真武汤抑制了UUO大鼠模型血清中Ang-Ⅱ和ILK蛋白的表达，减缓了肾间质纤维化的发展和进程。

输尿管梗阻；医学，中国传统；纤维化；血管紧张素Ⅱ；丝氨酸蛋白酶类；大鼠，Wistar

肾间质纤维化（RIF）几乎是各种肾脏疾病进展到终末期的共同途径和主要病理基础，可由多种原因引起的细胞外基质（ECM）在肾间质内过度沉积和间质成纤维细胞的增生而形成［1］。整合素连接激酶（ILK）是一种新发现的进化保守的黏附蛋白，属于一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，可与整合素β的胞质区相互作用，在不同类型的细胞中介导整合素信号传导，与RIF的发生关系密切［2-4］，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素血管紧张素系统（RAS）主要的生物活性肽，目前研究表明，AngⅡ在RIF的发生发展中发挥了多种病理生理作用［5-7］。本文应用酶联免疫法研究单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型RIF的动态变化过程中ILK和AngⅡ的动态变化以及真武汤的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药物 SPF级健康雄性Wistar大鼠150只，由黑龙江省中医药大学动物实验中心提供，体质量180～200g。真武汤饮片由黑龙江中医药大学附属第一医院饮片室提供；尿毒清颗粒：广州康臣药业有限公司。

1.2 主要试剂与仪器 尿蛋白测定试剂：南京建成生物工程研究所；ILK、AngⅡELISA试剂盒：武汉博德生物工程有限公司进口分装。日立7170A型自动分析仪：日本日立公司；全自动定量酶标仪：奥地利；移液器：法国吉尔森公司；电热恒温箱：上海一恒科技有限公司。

1.3 UUO大鼠模型的制备 大鼠适应性饲养1周，模型制备前1天禁食，自由饮水，用10%水合氯醛腹腔麻醉后，常规备皮、消毒、铺巾，取左侧肋腰点周围为手术切口，逐层切开皮肤、肌肉及腹壁各层，暴露左侧肾脏及肾蒂，分离左侧输尿管。假手术组仅切开腹腔并游离左侧输尿管，不做输尿管结扎，其他各组大鼠用4-0丝线结扎，局部给予适量青霉素，逐层缝合。

1.4 实验分组 将150只大鼠随机分为假手术组和造模组，其中假手术组21只，造模组129只；造模组大鼠分为5组，即为模型组、真武汤低剂量组、真武汤中剂量组、真武汤高剂量组和尿毒清对照组，模型组21只，真武汤低、中、高剂量组各27只，尿毒清对照组27只。

1.5 给药剂量及方法 真武汤组方和剂量参考《方剂学》（第五版）教材，低、中、高剂量组分别为7 g·kg-1·d-1、14 g·kg-1·d-1、28 g·kg-1·d-1，尿毒清颗粒：根据文献剂量为3.75 g·kg-1·d-1。

从术后第1天开始给药，每天灌服1次，假手术组和模型组给予等量的0.9%氯化钠注射溶液，分别连续灌服2周、3周和4周。

1.6 标本收集及检测 实验分为给药2周、3周和4周三个时间点进行研究，假手术组、模型组分别于给药后第2周、3周和第4周末随机各取材6只大鼠，真武汤低、中、高剂量组和尿毒清对照组分别取材8只大鼠，分别于取材前1天置代谢笼收集24 h尿液，采用日立7170A型自动分析仪检测24 h尿蛋白定量，收集血清采用ELISA法于全自动定量酶标仪检测ILK、AngⅡ的蛋白含量。

1.7 统计学处理 用SPSS 15.0进行数据处理，实验数据采用±s表示，组间数据比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），多重比较采用LSD检验。

2 结果

2.1 真武汤对各组大鼠24 h尿蛋白定量的影响各组24 h尿蛋白定量差异无统计学意义，各组24 h尿蛋白定量结果差异无统计学意义，见表1。

表1 各组大鼠24 h尿蛋白定量结果（±s，mg／24h）

表1 各组大鼠24 h尿蛋白定量结果（±s，mg／24h）

注：各组比较，均P＞0.05

组别 鼠数（只） 2周 3周 4周假手术组6 15.76±1.40 16.13±1.59 15.65±1.35模型组 6 15.89±1.47 15.78±1.56 16.17±1.57真武汤低剂量组 8 16.02±1.52 15.96±1.49 16.05±1.59真武汤中剂量组 8 15.97±1.48 16.10±1.53 16.06±1.55真武汤高剂量组 8 16.07±1.56 15.83±1.42 15.96±1.47尿毒清对照组8 15.97±1.48 16.12±1.55 15.89±1.53

2.2 真武汤对各组大鼠ILK蛋白表达的影响 与假手术组比较，模型组各时间点ILK蛋白表达显著增高，2周时最低，4周时最高，差异有统计学意义；与模型组比较，各药物组ILK蛋白表达均低于模型组，差异有统计学意义，随着时间的推移，降低的幅度逐渐减小；真武汤低、中、高剂量组比较，中剂量组ILK蛋白含量最低，见表2。

表2 各组大鼠血清中ILK蛋白表达的比较（±s，μg／L）

表2 各组大鼠血清中ILK蛋白表达的比较（±s，μg／L）

注：各时间点模型组与假手术组比较，aP＜0.05，cP＜0.01；各时间点药物组与模型组比较，bP＜0.05，dP＜0.01；各时间点尿毒清对照组与真武汤中剂量组比较，均P＞0.05

2.3 真武汤对各组大鼠Ang-Ⅱ蛋白表达的影响与假手术组比较，模型组各时间点Ang-Ⅱ蛋白表达显著增高，2周时最低，4周时最高，差异有统计学意义；与模型组比较，各药物组Ang-Ⅱ蛋白表达均低于模型组，差异有统计学意义，随着时间的推移，降低的幅度逐渐减小；真武汤低、中、高剂量组比较，中剂量组Ang-Ⅱ蛋白含量最低，见表3。

表3 各组大鼠血清中Ang-Ⅱ蛋白表达的比较（±s，μg／L）

表3 各组大鼠血清中Ang-Ⅱ蛋白表达的比较（±s，μg／L）

注：各时间点模型组与假手术组比较，aP＜0.05，cP＜0.01；各时间点药物组与模型组比较，bP＜0.05，dP＜0.01，各时间点尿毒清对照组与真武汤中剂量组比较，均P＞0.05

3 讨论

3.1 真武汤对24h尿蛋白定量的影响 UUO大鼠模型制备方法简单，成功率高，病理改变表现较早，是一种研究RIF发生机制、肾脏细胞转分化和评价RIF治疗方法的理想模型［8］。各组大鼠24h尿蛋白定量差异无统计学意义，说明各组间尿蛋白的排泄率相当与UUO模型肾小球损伤一致性较少。

3.2 真武汤对各组大鼠ILK蛋白表达的影响 本研究结果显示，模型组各时间点ILK蛋白表达较假手术组显著增高。经过真武汤治疗后，各药物组ILK蛋白表达较模型组明显降低。中剂量组ILK蛋白表达最低，说明真武汤可以降低UUO大鼠模型ILK的蛋白表达，中剂量组效果最佳。

3.3 真武汤对各组大鼠Ang-Ⅱ蛋白表达的影响

本研究结果显示，模型组各时间点AngⅡ蛋白表达较假手术组显著增高。经过真武汤治疗后，各药物组AngⅡ蛋白表达较模型组明显降低。中剂量组AngⅡ蛋白表达最低，说明真武汤可以降低UUO大鼠模型AngⅡ的蛋白表达，中剂量组效果最佳。

ILK和AngⅡ作为RIF发生发展的信号通路，AngⅡ通过TGF-β1-Smad诱导EMT，促进TGF-β1等的合成和分泌，从而使TGF-β1-Smad信号转导途径的下游效应因子ILK表达［9-11］。本研究中，真武汤能够同时降低ILK和AngⅡ的蛋白表达，从而发挥延缓肾小管损伤和RIF进程的作用，为临床应用打下了基础。

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Effect of Zhenwu decoction on integrin-linked kinase and angiotensinⅡin UUO rats

ZHOU Bo*，SONG Liqun，YUN Jie，ZHANG Danping，SONG Yeχu，MA Yanchun，CHEN Fangming
（*Department of Nephrology，Dazhou Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital，Dazhou 635002，China）

SONG Liqun，Email：qunli＠sina.com

ObjectiveTo research the effectof Zhenwu decoction on the expression of integrin linked kinase and angiotensin II，l and the renal interstitial fibrosis in UUO rats.MethodsThe ratmodel of renal interstitial fibrosis was successfully established by unilateral ureteral obstruction（UUO）.The ratswere divided into the control group and themodel group，and the Zhenwu decoction group（low dose，middle dose，high dose）and Niao Du Qing granules control group.The corresponding drug were administrated，and the urine and serum were collected after 2，3and 4 weeks.The level of24 hours urinary protein were tested by biochemical testing and the expression of integrin-linked kinase and angiotensionⅡwere determined by ELASA.ResultsZhenwu decoction could significantly reduce the expression of ILK and Ang-II in UUO ratmodel，and the lowest level of ILK and Ang-IIwere observed in themiddle dose group.ConclusionZhenwu decoction can inhibite the expression of Ang-Ⅱand ILK in the UUO ratsmodel，and slow the progress of renal interstitial fibrosis.

Ureteral obstruction；Medicine，Chinese traditional；Fibrosis；Angiotensin II；Serine proteases；Rats，Wistar

2014-03-20）

周波，医师，Email：13398332775＠163.com

宋立群，主任医师，教授，Email：qunli＠sina.com

R693.2

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.03.022