肝细胞生长因子联合缬沙坦对自发性高血压大鼠心肌细胞凋亡的影响

钱倩倩，王邦宁，胡泽平，宋兵，马东宇

（安徽医科大学第一附属医院心血管内科，合肥 230022）

肝细胞生长因子联合缬沙坦对自发性高血压大鼠心肌细胞凋亡的影响

钱倩倩，王邦宁，胡泽平，宋兵，马东宇

（安徽医科大学第一附属医院心血管内科，合肥 230022）

目的观察肝细胞生长因子（HGF）联合缬沙坦对自发性高血压大鼠（SHR）心肌凋亡的影响。方法24只14周龄雄性SHR随机分为4组（n=24）：阳性对照组（P组，常规饲养，无药物干预）、HGF组（H组，开胸，左心室壁五点直接注射5×109Pfu／m L Ad5-HGF，0.1 mL，术后常规饲养4周），缬沙坦组（V组，缬沙坦灌胃30 mg·kg-1·d-1，4周），HGF联合缬沙坦组（HV组，开胸，左心室壁五点直接注射5×109Pfu／mL Ad5-HGF，0.1 mL，术后缬沙坦灌胃30 mg·kg-1·d-1，4周），雄性Wistar大鼠（WKY）为健康对照（N组，n= 6）。治疗前及治疗后每周测量一次尾动脉压。4周后处死大鼠，TUNEL法测心肌凋亡指数，ELASA法测心肌HGF、caspase-3浓度，免疫组织化学法及图像分析系统分析心肌Bcl-xl水平。结果治疗4周后，HV组、V组血压较P组、H组明显下降（P＜0.05）；与P组相比，H组、V组、HV组心肌凋亡指数及心肌caspase-3浓度明显降低（P＜0.05），心肌HGF、抗心肌凋亡蛋白Bcl-xl水平明显升高（P＜0.05），且联合用药组尤为显著。结论HGF、缬沙坦均可有效抑制SHR左心室心肌细胞凋亡，改善心室重构，且联合使用效果优于HGF、缬沙坦的单独应用。

细胞凋亡；大鼠，近交SHR；肝细胞生长因子；抗高血压药；肌细胞，心脏

高血压左心室重构是发生各种心血管并发症的独立危险因素，与急性心肌梗死、急慢性心力衰竭、恶性心律失常、心脏性猝死等密切相关。目前研究证实心肌细胞凋亡是左室重构的细胞学基础［1］，其发生机制与高血压发展过程中肾素-血管紧张素系统（RAS）的激活有关，阻断RAS系统中发挥主要活性作用的血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）可以明显减少心肌细胞凋亡，延缓心室重构［2］。尽管血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）、AT1受体拮抗剂（ARB）等均可在不同程度上减轻AngⅡ介导的心肌细胞凋亡，延缓和（或）逆转左心室重构，但疗效有限，目前仍缺乏特异性的治疗药物。近年来研究表明肝细胞生长因子（HGF）与受体C-met结合后有很强的抑制细胞凋亡，抗间质纤维化，促血管形成作用，可在一定程度上改善并逆转高血压所致的心室重构，是心血管疾病发展过程的保护因子［3-4］。本课题组前期实验已证实HGF的抗心肌纤维化，逆转心室重构作用［5］。本研究的目的是选择HGF与AT1受体拮抗剂缬沙坦联合应用，观察对SHR心肌细胞凋亡的影响是否优于HGF或缬沙坦单独使用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 Wistar大鼠（WKY）6只，自发性高血压大鼠（SHR）24只，14周龄，雄性，体质量（250±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK（京2006-0009）。所有大鼠均在相同的条件下分笼饲养，每笼3～4只，动物房保持空气流通，恒温（22±2）℃，恒湿（55%±5%），24h自由取食和饮水，饲料由安徽医科大学实验动物中心提供。其中WKY大鼠（n=6）为健康对照组（N组），SHR大鼠（n=24）随机分为4组（n=6）：阳性对照组（P组）、HGF组（H组）、缬沙坦组（V组）、HGF联合缬沙坦组（HV组）。

1.1.2 药物及试剂 携有肝细胞生长因子的腺病毒（Ad5-HGF，中国军事医学科学院放射研究所），缬沙坦（北京诺华制药有限公司提供）。TUNEL凋亡试剂盒（Roche公司），ELASA试剂盒（上海源叶生物技术有限公司）；免疫组织化学分析试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司）。医用青霉素（哈药集团制药总厂）。

1.2 方法

1.2.1 转染Ad-HGF H组和HV组：根据本课题组前期实验手术经验，大鼠称重后，用10%水和氯醛（0.3 mL／100 g）腹腔注射麻醉，经口腔气管插管，连接动物呼吸机（HX-300，成都泰盟科技有限公司），呼吸频率设置为70～75次／min，潮气量6～8mL，呼吸比为1∶2。以大鼠左胸第三肋间为中心，通过2.5～3 cm开口暴露心脏。将0.1mL 5x109Pfu／mL Ad5-HGF通过直接注射的方式转染到左室游离壁的5个点，确切止血后，逐层缝合。术后肌注青霉素40万单位／次×3 d，常规饲养4周。

1.2.2 缬沙坦灌胃V组和HV组（术后） 每日清晨，予以缬沙坦（30mg·kg-1·d-1）加等量蒸馏水灌胃1次，常规饲养4周。

图1 治疗4周后各组大鼠心肌细胞TUNEL染色(×400)

图2 治疗4周后各组大鼠Bclxl免疫组织化学染色(×400)

插图3-2

1.2.3 心脏标本采集 饲养4周后处死大鼠，取出心脏，0.9%氯化钠注射溶液洗净，分离出左心室游离壁（包括室间隔），在左心室1／2处平行房室环水平横切，用-80℃冰箱保存，用于ELISA检测；一部分用10%甲醛固定、脱水、石蜡包埋，制成5μm切片，每个心肌组织制备5张切片，用于TUNEL、免疫组织化学检测。

1.2.4 TUNEL检测心肌细胞凋亡指数 凋亡试剂盒由Roche公司提供，严格按照说明书步骤操作。常规脱蜡水化，以下过程在湿盒中进行：PBS 5 min ×2；蛋白酶K通透15min；PBS5min×3；TUNEL反应混合液（TdT：生物素标记的dUTP=1：9）37°C孵育60 min；PBS 5 min×2；转化-POD 37°C30 min；PBS 5 min×3；DAB避光显色10 min，苏木素复染、常规脱水、透明、封片。在高倍镜（Olympus，×400）下检测，于凋亡阳性区域随机选择10个视野，用Image-Pro Plus6.0图像分析软件评定阳性细胞百分比（指阳性细胞占视野中所有细胞数的百分比），计算凋亡指数（AI）。光镜下，正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核散大呈棕色，单个散在分布。

1.2.5 ELASA法检测心肌HGF、caspase-3 实验步骤严格按说明书进行。取60～80 mg左室心肌组织，制成20%匀浆后离心，取上清液100μL，采用双抗体夹心法ELASA测定大鼠心肌的HGF、caspase-3水平。经过包被，加样，加酶标抗体，加底物液显色，终止反应后，在ELASA检测仪上，于450 nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，做标准曲线图。

1.2.6 免疫组织化学分析Bcl-xl水平 常规脱蜡水化，抗原修复，过氧化物酶灭活，山羊血清封闭，滴加一抗Bcl-xl（1：200），正常对照用PBS代替一抗，4℃过夜，滴加HRP标记的二抗（1：100）37℃孵育20 min，用DAB法显色，经复染、脱水、透明、封片。以胞浆内出现黄棕色颗粒表示为阳性表达。随机选择4个400倍显微镜视野图像，Image-Pro Plus 6.0图像分析软件检测Bcl-xl阳性细胞的平均吸光度值（MA）。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计学软件进行检验，多组间比较采用方差分析，组间两两比较用t检验。

表1 治疗前后各组大鼠血压比较（±s）

表1 治疗前后各组大鼠血压比较（±s）

注：与N组比较，aP＜0.05；与H组比较，bP＜0.05；与P组比较，cP＜0.05

?

表2 治疗4周后各组大鼠AI、Bcl-xl、HGF、caspase-3比较（±s）

注：与P组相比，aP＜0.05，与HV相比，bP＜0.05

?

2 结果

2.1 各组大鼠血压对比 治疗前：N组SBP、DBP明显低于P组、H组、V组、HV组（P＜0.05），后4组间血压差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗4周N组SBP、DBP显著低于P组、H组、V组和HV组（P＜0.05）；V组、HV组大鼠与P组和H组大鼠相比，SBP、DBP明显下降，组间差异有统计学意义（P＜0.05）；而P组与H组、V组与HV组血压变化差异无统计学意义，见表1。

2.2 各组大鼠心肌细胞凋亡指数对比 治疗4周后N组大鼠与其他4组相比未见心肌细胞凋亡（P＜0.05）；H组、V组、HV组与P组相比，凋亡指数降低且HV组降低明显（P＜0.05）；V组与H组凋亡指数差异无统计学意义，见表2，图1。

2.3 各组大鼠左心室心肌组织HGF、caspase-3比较 治疗4周后与P组比较，HV组的HGF含量显著增多（P＜0.05），其次为H组和V组；N组大鼠与其他4组相比仅有少量caspase-3表达（P＜0.05）；与P组相比，H组、V组、HV组caspase-3浓度明显下降，其中HV组下降更显著（P＜0.05）；V组与H组caspase-3浓度差异无统计学意义，见表2。

2.4 免疫组织化学分析心肌Bcl-xl 治疗4周后N组大鼠有Bcl-xl表达；与P组相比，H组、V组、HV组Bcl-xl的MA明显上升，其中HV组上升更明显（P＜0.05），V组与H组Bcl-xl的MA差异无统计学意义，见表2，图2。

3 讨论

高血压使心肌容量与压力负荷增加，并长期处于过度牵拉状态，室壁张力增高，氧化代谢持续上调，激活RAS系统参与高血压发病并维持，AngⅡ与AT1受体结合，使细胞内Ca2＋浓度升高、凋亡蛋白（如Bcl-xl，P53）表达发生改变、caspase-3活化及细胞核间DNA断裂等，引起线粒体膜电位改变通透性增加，释放细胞色素C，触发心肌细胞凋亡，致使心肌肥厚及心腔扩大，发生心室重构。

本研究结果表明，与健康对照组相比较，阳性对照组血压明显升高，凋亡细胞明显增多，证实SHR疾病过程中发生心肌细胞凋亡，出现高血压心脏损害；缬沙坦组及联合用药组血压较阳性对照组明显下降，同时凋亡细胞减少，表明降低血压可以降低心室壁张力，从而减轻了对心肌细胞凋亡的刺激［6］。本研究显示HGF与缬沙坦均可抑制心肌细胞凋亡、促进Bcl-xl蛋白表达与降低caspase-3浓度，说明HGF与缬沙坦对心肌具有保护作用，并与Cao［7］和Yasuda［2］的研究结果基本一致，且联合用药后抗心肌细胞凋亡作用优于单一用药，Bcl-xl表达明显上调，caspase-3下降显著。

Bcl-xl是抑制凋亡的Bcl-2家族蛋白，可通过干扰caspase-3的活性从而抑制细胞凋亡［8］，也可在线粒体外膜和其他促凋亡蛋白形成异源二聚体直接维持线粒体膜的正常状态，抑制细胞色素C的释放，从而发挥其抗凋亡的作用［9］。caspase-3参与凋亡过程的终末期，在细胞内凋亡途径中，细胞内死亡信号诱发线粒体释放细胞色素C，并形成凋亡复合，激活caspase-3降解底物使细胞凋亡［10］。本实验结果显示联合组HGF较HGF组升高明显，提示应用缬沙坦后心肌HGF表达增加［11］，并且阻断AngⅡ通过AT1R介导caspase-3的活化［12］。联合组局部升高的HGF可以显著抑制AngⅡ及AT1受体的表达［13］，并通过C-met途径抑制AngⅡ活化后介导的凋亡［14］，稳定Bcl-xl mRNA并上调Bcl-xl的表达［7］，进一步阻碍内源性细胞凋亡途径，减少心肌细胞凋亡。

综上所述，HGF与缬沙坦均使SHR左心室心肌细胞凋亡减少，且联合较单一使用能更有效抑制SHR左心室心肌细胞凋亡，改善心室重构，其作用机制可能与降压，上调心肌局部的HGF、Bcl-xl及抑制caspase-3的表达有关。

（本文图1，2见插图3-2）

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Effects of hepatocyte grow th factor and valsartan on myocardial apoptosis in spontaneously hypertensive rats

QIAN Qianqian，WANG Bangning，HU Zeping，SONGBing，MADongyu
（Departmentof Cardiology，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022，China）

WANGBangning，Email：wangbangning＠medmail.com.cn

Ob jective To observe the effect of HGF combined with valsartan on myocardial apoptosis in spontaneously hypertensive rats.Methods24-old male SHRs age，14-week，were random ly divided into 4 groups：positive control group（P group，conventional breeding，with no drug intervention），HGF group（H group，the left ventricle wallswere injected with 0.1ml 5x109Pfu／mL Ad5-HGF at five different points after thoracotomy and then fed them normally for 4 weeks），valsartan group（V group，intragastric administration of valsartan 30 mgokg-1od-1 for 4 weeks），HGF plus valsartan group（HV group，the left ventricle walls were injected with 0.1ml 5x109Pfu／mL Ad5-HGF，at five different points after thoracotomy and then valsartan at a dose f 30 mgokg-1od-1was intragastrically administrated for 4 weeks），and male Wistar rats（WKY）were used as normal controls（N group，n=6）.The tailblood pressurewasmeasured once aweek before and after treatment.The ratswere sacrificed at the 4th week.Themyocardial apoptosis index wasmeasured by TUNEL，and the concentration ofmyocardial HGF and caspase-3 wasmeasured by ELASA，the level ofmyocardial Bcl-xlwas analyzed by immunohistochemistry and image analysis system.ResultsAfter 4 weeks＇treatment，blood pressure in HV group and V group significantly decreased（P＜0.05）.Compared with P group，H group，V group and HV group showed significant decrease inmyocardial apoptosis index and myocardial caspase-3 levels（P＜0.05），while increase in myocardial HGF and antimyocardial apoptosis protein Bcl-xl levels（P＜0.05）.Compared with H group or V group，HV group showed better effect.（P＜0.05）.ConclusionThe combination of HGF and valsartan have better effect on myocardial apoptosis ofSHR ventricular than HGF or valsartan alone.

Apoptosis；Rats，Inbred SHR；Hepatocyte Growth Factor；Antihypertensive Agents；Myocytes，Cardiac

R329.25；R544.1

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.03.020

2013-11-08）

安徽省自然科学基金项目资助（11040606M157）

钱倩倩，硕士在读，Email：angie＿qian＠163.com

王邦宁，主任医师，教授，博士生导师，Email：wangbangning＠medmail.com.cn