新疆牧区酸奶粒中乳酸菌的筛选

魏晖　张东军

摘要：以MRS和Elliker培养基，对采自新疆传统奶疙瘩中的乳酸菌进行分离，首先将样品进行富集培养，对样品进行活化。再通过涂布平板法和划线分离法初步筛选。对平板菌落参考常规乳酸菌分离鉴定方法进行初步鉴定，然后对初步分离到的细菌进行划线分离纯化，得到的纯种菌落进行革兰氏染色、镜检、H2O2酶试验，将革兰氏阳性、无芽孢、H2O2酶阴性的菌株暂定为乳酸菌。经形态学和生化试验，得到初步定为乳酸菌的菌株3株。

关键词：奶疙瘩 乳酸菌 分离

中图分类号：TS252.1 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）08-0040-04

乳酸菌是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称，自然界广泛存在，用乳酸菌发酵食品不产生任何毒素或毒性物质，而且乳酸菌还具有改善和平衡肠道、增强胃肠功能的作用，在增进人们体质与健康方面能达到食疗兼收的效果。全国各地均有不同形式的乳酸菌发酵食品在市场销售或民间流传，新疆有当地独特的乳酸菌发酵乳制品：酸奶疙瘩、酸奶干等十余种产品，营养丰富、老幼皆宜。

无论对哪种乳酸菌发酵食品来说，所用乳酸菌的数量、形态、特异性能等对产品质量优劣都起着重要的作用。本研究从新疆牧区酸奶粒中分离纯化出具有典型乳酸菌菌落形态的菌株，用MRS培养基、M17培养基、Elliker培养基及其对应CaCO3改良培养基进行分离，然后进行生理生化鉴定，从而筛选纯化出优良菌株。

本研究主要针对新疆牧区的乳制品进行乳酸菌的分离鉴定，并进行产酸特性的研究，旨在了解新疆传统乳制品中乳酸菌的种类，并了解其产酸情况以丰富我国的乳酸菌资源。

1 实验材料

1.1 菌种

醋酸菌、啤酒酵母菌：来自河南工业大学发酵工程实验室。

1.2 原料

酸奶疙瘩来自新疆牧区；脱脂牛奶，购买于丹尼斯超市；马铃薯，购买于农贸市场；鲜牛奶，购买于奶牛场。

1.3 主要仪器（如表1）

1.4 主要试剂（如表2）

1.5 培养基及试剂

1.5.1 试剂

3%过氧化氢溶液；明胶；硝酸；革兰氏剂。

1.5.2 培养基

MRS培养基（半选择性培养基）：调pH至6.2～6.4，121℃湿热灭菌20min，杆菌是区系中主要菌时，常用MRS琼脂作分离用培养基，此培养基主要用于乳酸杆菌和其他乳酸菌。

PY培养基：将各种材料混合溶解于300mL蒸馏水中，再加500mL水，一边搅拌一边缓慢加入其他盐类。继续搅拌直到全部溶解，加200mL蒸馏水，混合后贮备于4℃。

PYG培养基：在PY基础培养液内加入1.0g葡萄糖即成为PYG培养基。

2 实验方法

2.1 乳酸菌的分离

2.1.1 样品采集与处理

试验前，将样品的表面先用无菌生理盐水清洗，再切碎、研磨，然后以1：9（g/mL）的比例置于MRS液體培养基中富集培养，培养条件为37℃厌氧培养24～72h。

2.1.2 乳酸菌的分离方法

第一、将富集活化样品用无菌生理盐水分别稀释到10-2、10-3、10-4三个稀释度。

第二、分别吸取1mL样品于MRS培养基培养皿内.将10-1、10-2、10-3、10-4每个稀释度分别划线和涂布一次。置于恒温培养箱中37℃培养72h。

第三、观察菌落的形态，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及周围培养基亦为黄色者初步定为目标菌株，挑取单个可疑菌落，反复划线，直至获得纯的菌株。

第四、将分离纯化得到的菌株进行革兰氏染色、镜鉴。

2.2 生理生化鉴定

2.2.1 葡萄糖产酸产气实验

（1）培养基：在PY基础培养基内加入30g葡萄糖和 0.5mL的吐温80，再添加6g琼脂做成软琼脂柱。分装试管，高度4-5cm。为便于观察产酸情况，可在培养基内加入浓度为1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL指示剂，置于112℃灭菌20min。

（2）接种和培养：用较大量的新鲜活力强的菌种进行穿刺接种，然后在上加盖一层约7mm厚的2%琼脂，置于37℃培养。

（3）结果观察：培养基中指示剂变黄表示产酸；软琼脂柱内产生气泡或出现将2%琼脂层向上顶的现象，表示产气。

2.2.2 淀粉水解实验

（1）培养基：在PY基础培养基，在其中加入0.5g可溶性淀粉，分装试管，112℃灭菌30min。（2）接种和培养：接种新鲜活跃菌种，37℃培养2d。（3）结果与检测：向试管中加入卢哥氏碘液，观察试管中培养液颜色变化，接种试管不显色表示淀粉水解，显蓝黑色或蓝紫色时，表示淀粉未水解或水解不完全。

2.2.3 甲基红实验

（1）培养基：PYG培养基，分装三角瓶，（2）接种和培养：将新鲜活跃菌种接种于试管，用一个三角瓶作对照37℃培养2d。（3）结果与检测：向三角瓶中加入几滴甲基红酒精溶液，如果变红，则为阳性。

2.2.4 乙酰甲基甲醇试验

（1）培养基：PYG培养基，分装三角瓶。

（2）接种和培养：将新鲜活跃菌种接种于试管，用一个三角瓶作对照，37℃培养2d。

（3）结果与检测：取1mL培养液，加入1mL10%的NaOH混匀，再加入3～4滴氯化铁，数小时后，培养基表面下层出现红色者，为阳性。

2.2.5 石蕊牛奶实验

（1）培养基：每100mL脱脂牛奶加4mL浓度为25g/L的石蕊牛奶分装试管。牛奶高度4～5cm 113℃灭菌15-20min。（2）接种和培养：接种新鲜活跃菌种，37℃培养2d。（3）结果与检测：37℃培养1～3d即可观察石蕊牛奶产酸和凝固反应。

2.2.6 硫化氢的产生

（1）培养基：胰蛋白胨10g；牛肉膏3g；酵母提取物5g；NaCl 5g；半胱氨酸0.4g；葡萄糖2g；蒸馏水1L。调pH至7.2～7.4经113℃灭菌20min。

（2）乙酸铅试纸条的制备：将普通滤纸剪成约0.5～0.6cm的宽纸条，长度根据试管和培养基高度而定。用浓度为50～100g/L的乙酸铅将纸条浸透，然后置于烘箱里烘干，放入试管内，灭菌后备用。

（3）接种和结果观察：将新鲜培养物接种于培养液后，用无菌的镊子夹取一乙酸铅纸条悬挂于接种管内。下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧。试验中设空白对照，在未接种的试管培养基上悬挂乙酸铅纸条。另外接种已知菌的阴性反应做对照。置于37℃培养，进行观察比较，纸条变黑为阳性反应。

2.2.7 明胶液化实验

（1）培养基：蛋白胨1g；酵母提取物1g；葡萄糖0.1g；盐溶液4.0mL；H2O100mL。调pH至7.0，分装试管加明胶0.6g/管，加煮沸液5mL/管，113～115℃ 15～20min。（2）接种和培养：接种后置于37℃培养3d，培养时有两只未接种的试管作对照。（3）结果观察：从培养箱里取出试管，低温处理，待对照管凝固，记录结果，如果对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，同时凝固或液化为阴性结果。

2.2.8 纸层析

（1）展开剂：水：苯甲醇：正丁醇按体积比1：5：5的量混合，然后加1%的甲酸。（2）显色剂：0.04%溴酚蓝酒精溶液，用0.1mol/LNaCl调pH6.7。（3）结果与观察：展析上行25cm后，取出晾干后喷显色剂，观察样品上是否出现黄色斑点，并与对照比较，以2%的乳酸为对照。

3 实验结果与讨论

3.1 乳酸菌的分离和纯化

从新疆酸奶疙瘩中通过MRS平板分离纯化出三株疑似乳酸菌，分别为乳酸长杆菌、乳酸短杆菌和乳酸链球菌。进一步进行是否产乳酸测定、革兰氏染色以及生理生化鉴定。

3.2 乳酸菌的鉴定

3.2.1 细胞形态及菌落特征

根据图3-1、表1和表2，按照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《一般细菌常用鉴定方法》可知，Lacto-A、Lacto-B为乳杆菌，Lacto-C为乳链球菌。

3.2.2 菌株生理生化鉴定

3.2.2.1 葡萄糖产酸产气实验

通过用较大量的新鲜活力强的菌种对葡萄糖培养基进行穿刺接种，然后在上加盖一层约7mm厚的2%琼脂，于37℃培养。结果见图3-2培养基中指示剂变黄而对照组颜色不变，说明分离的菌株产酸；图3-3软琼脂柱内产生气泡，说明分离菌株产气。

3.2.2.2 淀粉水解实验

在PY基础培养基中加入可溶性淀粉，接种新鲜活跃菌种，37℃培养2d。然后向试管中加入卢哥氏碘液，观察接种管与对照组试管中培养液的颜色变化，结果见图3-4接种试管不显色说明分离菌株水解淀粉，对照组显蓝黑色说明淀粉没有被水解。

3.2.2.3 甲基红实验

通过将PYG培养液，分装三角瓶，将新鲜活跃菌种接种于三角瓶，用一个三角瓶作对照37℃培养2d。向三角瓶中加入几滴甲基红酒精溶液，结果见图3-5接种组的三角瓶中培养液变红，说明分离菌呈阳性。

3.2.2.4 乙酰甲基甲醇试验

通过取1mL培养液，加入1mL10%的NaOH混匀，再加入3-4滴氯化铁，数小时后，结果见图3-6培养液表面下层出现红色，说明分离菌株为阳性。

3.2.2.5 石蕊牛奶实验

通過向石蕊牛奶分装试管中接种新鲜活跃菌种，37℃培养1～3d，结果见图3-7观察接种组石蕊牛奶颜色变为粉红色并发生凝固反应，对照组没有变化，说明分离菌产酸。

3.2.2.6 硫化氢的产生

将浸透浓度为50～100g/L的乙酸铅并烘干的约 0.5～0.6cm宽的滤纸条，用无菌的镊子夹取悬挂于接种管内。下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧。试验中设有的空白对照，在未接种的试管培养基上悬挂乙酸铅纸条。置于37℃培养，结果见图3-8接种管的纸条变黑，说明分离菌产H2S气体，将乙酸铅中的铅离子还原为铅，即滤纸显黑色，说明分离菌为阴性反应。

3.2.2.7 明胶液化实验

从培养箱里取出试管，将对照组和接种管低温处理，待对照管凝固，结果见图3-9对照管和接种管同时凝固，说明分离菌显阴性。

3.2.2.8 纸层析

发酵液中乳酸菌生成大量的乳酸，发酵液中加入5%的碳酸钙，搅拌后，缓缓加入H2SO4到pH值为2.0，高速离心机5000rpm，离心10min，然后取上清，经真空回旋蒸发浓缩到原体积的1/10体积，与2%的乳酸作对照，与样品平行点样层析。结果，喷0.04%的溴甲酚蓝酒精溶液后，样品上是否出现黄色斑点，发酵液斑点与2%乳酸对照组上升同等高度（见图3-10），说明，分离菌产乳酸，即分离菌为乳酸菌。

4 结论

（1）富集培养的MRS平板长有较多的乳酸菌，并且不易染菌，直接划线法做的MRS平板没有长出乳酸菌。由此，酸奶疙瘩在分离乳酸菌之前要进行活化。 （2）经过各种鉴定得出，所分离出的菌为乳酸菌，经镜检为乳酸杆菌、乳酸球菌。

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