茯苓、黄芪免疫成分最佳提取工艺的研究

胡瑞君　温平　王良　刘复军　李金宝

摘要：以茯苓、黄芪提取液中多糖和甲苷的含量及出膏率为指标，采用正交设计及分光光度法对提取工艺条件进行优选，结果为浸泡12h，浸提1次，料水比1：15，细粉粒度为最佳。

关键词：茯苓 黄芪 多糖 黄芪甲苷 含量测定

中图分类号：P284 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）08-0014-02

1 引言

茯苓为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，多糖为其主要成分之一，具有抑制肿瘤生长，调节机体免疫等功能[1]。黄芪为豆科植物，其主要成分为黄芪甲苷、多糖等，所含黄芪甲苷具有增强免疫力、抗疲劳，保肝等作用[2]，黄芪多糖由己糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等组成，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤等作用。茯苓和黄芪均有增强免疫系统活性和抑制肿瘤细胞增殖等作用，两者配伍，标本兼治，提高药效。因此，我们以多糖和甲苷的含量及出膏率为指标，采用正交设计及分光光度法考察不同提取工艺对茯苓和黄芪免疫成分的影响，为茯苓和黄芪的合理利用提供依据。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

茯苓、黄芪购自哈尔滨市药材批发市场。

黄芪甲苷标准品（中国药品生物制品检测所），其它试剂为国产分析纯。

2.2 仪器设备

UV1102型紫外可见分光光度计；FW80型高速万能试样粉碎机、HH-S数显恒温水浴锅、DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱、SHB-3循环水多用真空泵、201D-Ⅱ旋转蒸发器、BS200S电子天平。

2.3 方法

2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

准确称取无水葡萄糖对照品（105℃干燥至恒重）20.2mg，加水溶解并定至100mL，此即葡萄糖标准品溶液。分别吸取葡萄糖标准溶液0.0，0.1，0.2，0.4，0.6和0.8mL置具塞试管中，各加水至1.0mL，再各加5%苯酚溶液2.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸6.0mL，迅速摇匀，置沸水浴中加热30min，取出，置冷水浴中迅速冷却至室温，另以1mL蒸馏水同样操作，做空白对照。在490nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=54.18C+0.0294（R=0.9979）。

2.3.2 黃芪甲苷标准曲线的绘制

准确称取黄芪甲苷标准品（干燥至恒重）5.2mg，用无水乙醇溶解并定容至10mL，此即黄芪甲苷标准溶液。分别吸取黄芪甲苷标准溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4 和0.5mL，各加无水乙醇至0.6mL，再加入8%（w/v）香草醛无水乙醇试剂0.5mL，摇匀。加入72%硫酸5mL，摇匀后置于62℃水浴保温20min，取出，置冷水浴中迅速冷却至室温，另以0.6mL无水乙醇同样操作，做空白对照。在538nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：A=21.53C+0.0186（R=0.9988）。

2.4 提取工艺的确定

在每次提取时间不变的情况下，选择浸泡时间、提取次数、料水比和药材粒度为因素[3，4]，选用L9（34）因素水平表安排正交试验，各因素水平见表1。称取茯苓和黄芪（各100g）9份以表2的9种工艺条件组合进行煎煮提取，最后确定最佳提取工艺。

2.5 提取过程中样品溶液制备

将2.4所提取的样品溶液浓缩至100mL，置烘箱中出膏，称取浸膏1g置于烧杯中，用少量95%的乙醇溶解，移出上清液，反复操作2次，合并上清液待用。将沉淀用水溶解并定容至100mL，从中吸取1mL移入25mL容量瓶中定容，此即待测的多糖样品溶液。

合并上清液，置沸水浴中挥干乙醇，然后用20mL水溶解，置于分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次10mL。合并萃取液，用饱和正丁醇10mL洗1次，减压浓缩至干。以50%甲醇20mL溶解浓缩物，溶液以0.5mL/min的速度通过中性氧化铝柱（4g，100～200目，柱长15cm），并继续用50%甲醇40mL冲柱。合并通过液及洗液，减压浓缩至干，以无水乙醇溶解并定容至25mL容量瓶中，此即待测的甲苷样品溶液[5]。

3 结果与分析

按2.4设计提取工艺进行试验，结果见表2。从出膏率、多糖含量及甲苷含量等方面进行综合评分，满分为100分，其中出膏率、多糖含量、甲苷含量的权重分别为20分、50分、30分。以评分结果作为衡量提取工艺的指标。出膏率10%为20分，25%为0分，多糖含量20mg/g为50分，5mg/g为0分，甲苷含量0.60mg/g为30分， 0.10mg/g为0分。

从表2正交表的结果可知，提取最佳工艺条件组合为A2B1C3D3，按照所得最佳工艺条件提取，平行做三次，得分为74.24。考虑到料水比对浓缩、出膏时耗能、耗时影响大，所以选择A2B1C2D3组合，即浸泡时间为12h，浸提1次，料水比1：15，细粉粒度为最佳。

4 结论

茯苓、黄芪所含多糖、甲苷均为可调节人体免疫功能的成分，对其提取工艺优化的研究为茯苓和黄芪的合理利用提供依据。通过实验，得出茯苓、黄芪复方免疫成分最佳提取工艺为：浸泡时间为12h，浸提1次，料水比1：15，细粉粒度。

参考文献

[1]刘林，霍志斐，史树堂，等.茯苓多糖的药理作用概述[J].河北中医，2010，32（9）：1427.

[2]杨晓雷，曹云.从黄芪生药中提取黄芪甲苷的工艺研究[J].现代化工，2008，28（2）：373.

[3]郝建萍，王昌利，孙静.不同切制法对茯苓中茯苓多糖含量的影响[J].陕西中医学院学报，2010，33（1）：55～56.

[4]黄际薇.正交法优化黄芪中黄芪甲苷提取工艺研究[J].广东药学院学报，2005，21（3）：257.

[5]李津明，单寅新，孙仁爽，等.茯苓和黄芪最佳精制工艺的研究[J].哈尔滨商业大学学报（自然科学版） ，2006，22（3）：5～7.