纳豆生产中油脂对枯草杆菌产纳豆激酶的影响研究

魏晖　马川兰

摘要：纳豆作为一种传统的发酵食品，在日常生活中扮演者十分重要的角色。其在发酵过程中产生的纳豆激酶是一种溶栓性很好的物质，其作用远远超过溶栓酶等物质在人体中发挥的作用，因此其生产越来越受到人们的重视。本实验旨在通过纳豆原料中油脂对产酶的影响，确定最大的产酶量，以此来提高产酶效率，达到在酶产量不变的情况下获取油脂副产品，以便降低生产成本，便于工业产酶的大量生产。结果：在豆粕残油量1%计算下，额外添加梯度油脂对枯草芽孢杆菌活菌产酶的影响不显著。

关键词：纳豆 纳豆激酶 油脂

中图分类号：TQ920.4 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）08-0001-04

1 引言

納豆是日本的一种传统发酵食品，由黄豆经过纳豆芽孢杆菌发酵而成[1]。生产工艺是将煮熟的大豆冷却后接种纳豆菌种，经过恒温发酵、4℃左右后熟等工艺制成，其成品有金黄的色泽，口感较为酥软，挑起时呈现出较长的拉丝现象[2]，当用纳豆与适宜作料配制后可制作成为可口的美食。纳豆激酶（nattokinase，NK）是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌产生。作为纳豆生产中的主要含有物，其重要的溶纤维和溶栓[3]等作用已经在临床以及保健品剂中得到了广泛的应用，同时因其副作用小、溶栓彻底等特点已经得到医学和养生学家的重视。

随着粮食作物成本及劳动成本的不断提高，降低成本资金投入，增大原料利用率、提高产品的提取率已经成为亟待解决的问题，因此，在成本不变甚至不断增加的情况下，降低原料的投入，扩大收益率，增加产率已经成为必要途径。本文研究了纳豆生产中油脂对枯草芽孢杆菌产酶的影响，通过此研究来确定油脂在纳豆发酵过程中对枯草杆菌产酶的影响，以便达到生产酶制品的同时对大豆油脂进行部分提取，以便降低成本，提高原料利用率达到生产原料的优化配置和转化，以实现企业效益的最大化。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 生产菌株

日本株式会社赠送，菌株类型为枯草芽孢杆菌。

2.1.2 主要仪器（见表1）

2.1.3 主要试剂及配制方法

2.1.3.1 主要试剂

分析纯试剂：三氯乙酸、磷酸、磷酸二氢钠、氢氧化钠、无水碳酸钠、氯化钠、盐酸、钨酸钠、钼酸钠、液体溴、硫酸锂、无水乙醇；生化试剂：干酪素、酪氨酸、酵母膏、蛋白胨、琼脂。

2.1.3.2 主要试剂配制方法

（1）2%酪蛋白溶液：准确称取干酪素5.000g，浸泡于50mL 0.1N NaOH溶液中放入冰箱中过夜，水浴中加热煮沸使之溶解，再用pH7.5缓冲液定容至250mL的容量瓶中，放入冰箱贮藏。

（2）酪氨酸标准溶液：取酪氨酸放入105℃干燥箱中烘干至恒重，精确称取0.1g酪氨酸干粉，用少量0.2N盐酸溶解并用蒸馏水定容至100mL，浓度为1000μg/mL。

（3）Folin-酚试剂：称取钨酸钠（Na2Wo4·2H2O）10g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）2.5g，加蒸馏水70mL于250mL的烧瓶中溶解。后加入85%的H3PO4 5mL，浓HCl 10mL，使用回流装置，使其慢慢沸腾10个小时。停止加热，冷却后称量硫酸锂（Li2SO4·H2O）15g，水5mL，液体溴2-3滴，开口继续煮沸15min，使溴水尽量挥发。待冷后用水稀释至100mL，过滤后放入深色瓶中，保存于阴凉处（假如呈绿色，应该继续加数滴液体溴，继续蒸煮15min），显色时加水2倍。

（4）0.4M三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸晶体6.536g用蒸馏水定容于100mL容量瓶中，用棕色试剂瓶保存于避光干燥处。

（5）0.2M pH7.5磷酸盐缓冲液：准确称取Na2HPO4 23.876g；NaH2PO45.196g溶解于500mL蒸馏水中保存。

（6）0.4M Na2CO3溶液：准确称取无水碳酸钠4.2396g，溶解于100mL蒸馏水中保存。

（7）0.1N NaOH溶液：准确称取NaOH 0.4001g，溶解于100mL蒸馏水中。

（8）0.9% NaCl溶液：准确称取NaCl 0.9000g，溶解于100mL蒸馏水中保存。

2.1.4 培养基[4]

（1）LB固体培养基：NaCl 1.000g，琼脂粉1.500g，酵母膏0.500g，蛋白胨1.000g，pH7.0-7.5；（2）LB液体培养基：NaCl 2.000g，蛋白胨2.000g，酵母膏1.000g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.5。

2.2 方法

2.2.1 纳豆生产的工艺流程

2.2.1.1 种子液制备

（1）配制：用电子天平称取酵母膏1.000g；蛋白胨 2.000g；NaCl 2.000g；后用200mL蒸馏水溶解于500mL烧杯中；充分溶解，用玻璃棒搅拌均匀后，冷却至常温后用pH试纸测定pH值，后用1N的NaOH溶液调节pH在7.0-7.5之间，以达到发酵的要求；（2）分装：种子液配好后，冷却至常温后用100mL量筒准确量取50mL分装入4个250mL三角瓶中；（3）灭菌：将配好的液体培养基放入高压蒸汽灭菌锅中，设置温度为121℃高压蒸汽灭菌20min，灭菌结束后置于超净工作台中冷却以待接种；（4）接种：取灭菌后的试管用移液器准确量取10mL无菌水，用接种针无菌操作粘取保藏于试管斜面的菌体（1-2环），溶解于无菌水（10mL左右）中，后使用涡流混悬器充分混匀，结束后，用移液器（移液管）分别取2mL菌悬液加入到4个（培养液50mL）灭菌后的250mL三角瓶中，摇匀后用4层纱布包好；（5）培养：将4瓶接种好的液体培养基置于恒温振荡培养箱中，设置温度为37℃，恒温摇床转速150rpm，培养时间为16h，作为种子液使用。

2.2.1.2 纳豆发酵过程[5]

（1）浸泡：分别称取20g豆粕，分装入8个标号（P1，P1+，P2+……P7+）的250mL三角瓶中，加入35mL或者60mL蒸馏水，根据浸湿情况适当增加或者减少加入水量（每个三角瓶中加水量相同），保证用手指按压时有湿润感但无水浸出，保证发酵过程的正常进行。搅拌结束后置于常温下放置16h左右，使豆粕充分吸水。 （2）蒸煮：取充分浸泡吸水的豆粕（搅拌观察浸水情况，适当添加，保持水分），用四层纱布和报纸包扎好后放入高压蒸汽灭菌锅中蒸煮，设定蒸煮温度121℃，设定高压蒸汽灭菌锅蒸煮时间为30min，使豆粕充分成熟。（3）接种：用移液器吸取培养后的种子液2mL，加入到在超净工作台中冷却（蒸煮后的豆粕冷却温度保证在40℃左右）的豆粕中。（4）油脂添加：接种结束后，按照梯度（0.00，1.00，1.50，2.00，2.50……4.00）加入大豆油脂，用玻璃棒搅拌均匀后用4层纱布包扎好。（5）发酵[2，3]：将接种后搅拌均匀的豆粕产品放入恒温培养箱中进行发酵处理，设定温度为35℃，培养时间为24h。（6）后熟：发酵结束后，调节恒温培养箱温度，重新设定为4℃，开始进行后熟处理，使豆粕充分成熟，保证豆粕原料的充分发酵，以达到风味和感官的优化。（7）水分含量测定：分别称取干豆粕粉、后熟的产品准确记录其质量，用红外水分测定仪测定其水分含量。

2.2.2 酪氨酸标准曲线的绘制

吸取稀释酪氨酸标准溶液，后用蒸馏水进行10倍稀释，按照表进行操作，后用移液器吸取稀释后的溶液1mL，加入0.4M的碳酸钠溶液，在40℃水浴中预热5min后用移液器加入1mL Folin-酚试剂，置于40℃水浴锅中显色20min后测定吸光值，绘制酪氨酸标准曲线。

2.2.3 纳豆激酶活力的测定[6，7]

2.2.3.1 粗酶液的提取

（1）浸泡：将后熟结束的发酵豆粕放入超净工作台中，无菌操作，从各个发酵的三角瓶中取出部分发酵豆粕，在电子天平上称取4g左右，将豆粕加入到标号的离心管中，后用移液管量取10.00mL的0.9%的生理盐水（0.9% NaCl溶液），搅拌均匀后，放置2h，并不时的搅拌以最大限度的使酶液得到浸提，将离心管平放于试验台。

（2）离心：浸提结束后，于离心机中进行离心处理，设定温度为15℃，转速5000转，离心10min以得到纳豆发酵的产品纳豆激酶的粗产品。

2.2.3.2 酶活力的测定[8]

（1）稀释：用移液器吸取离心后的粗酶液1.00mL，用49.0mL 0.2M pH7.5的磷酸盐缓冲液溶解稀释； （2）样品处理：①反应（A样品）：用试管分别取1.00mL稀释后的酶液，放入40℃水浴锅中预热，同时40℃预热2%酪蛋白溶液，准确预热5min后用移液器准确量取1.00mL酪蛋白溶液加入1号试管，同時用秒表准确计时，迅速振荡试管，使溶液混合均匀，保证纳豆激酶与酪蛋白充分接触，1min后加入第2管，按照上述方法依次重复第1管操作；10min后取出第1管，立即加入5mL 10%的三氯乙酸（AcCl3）溶液终止酶促反应，振荡均匀后继续放入40℃水浴锅中放置15min，11min后取出第2管，按照第1管操作加入5mL 10%的三氯乙酸（AcCl3）溶液，依次重复，全部结束后，再次40℃水浴放置15min；②对照（A对照）：用移液器准确吸取1.00mL稀释后的酶液加入试管中，置于40℃水浴锅中预热5min左右，先用移液管准确加入5mL 10%的三氯乙酸溶液，并按照反应组操作，用秒表准确计时，摇匀后继续放入40℃水浴锅中保持15min，并不断震荡，使酶充分失去活性，15min后用移液器加入1.00mL 40℃水浴锅中预热的酪蛋白溶液，振荡均匀后，按照（i）中操作，用秒表计时后于水浴锅中放置10min；③过滤：酶促反应结束后分别把①，②中反应液过滤，留取滤液待用；④显色：分别取反应滤液、对照滤液、蒸馏水各1.00mL加入到3支试管中，分别加入5mL 0.4M Na2CO3溶液，振荡均匀后40℃水浴锅中预热5min，并用秒表准确计时，用移液器加入1.00mL Folin-酚试剂，并迅速振荡均匀，1min后加入第2管，依次重复操作，反应显色20min结束后迅速将显示液置于冷水中，以终止显色，减小误差；⑤OD值测定：显色结束后，用添加蒸馏水显色组作为对照进行调零，分别测定对照液和反应液的OD值以计算酶活力。

3 结果与讨论

3.1 酪氨酸标准曲线

在680nm处测定一系列酪氨酸标准溶液显色后的吸光度，以酪氨酸浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，从而得到标准回归方程Y=0.0101X+0.0055，其中相关系数R2=0.9970，酪氨酸浓度在0.01mg/L-1.00mg/L的范围内，其与显色剂Folin-酚试剂显色后的络合物吸光度呈现出良好的线性关系，因此可以根据此标准曲线（图1）对产酶结果进行有效分析。

3.2 油脂添加前后纳豆激酶活力测定结果

在10%接种量下，添加油脂梯度，分析大豆油脂在纳豆发酵过程中对枯草杆菌产酶的影响，其中油脂梯度如表所示，1号为为添加油脂的空白样，其余为梯度添加对照。

利用0.9%的氯化钠溶液进行发酵产品中纳豆激酶的提取，得到粘度相对较大的纳豆激酶粗酶液，经过pH7.5的磷酸盐缓冲液稀释之后，反应组进行正常的酶促反应，而对照组则先进行酶的失活，并以此为对照，将反应滤液用Folin-酚试剂进行显色反应，根据酶促反应后各个样品的吸光值（见表2）与酪氨酸浓度在一定范围内良好的线性相关性来计算纳豆激酶的活力（见表3）。

3.3 油脂单因素试验结果分析

此试验为小样本，同时有多个油脂添加梯度，需要进行多重检验，所以此分析可以采用F检验的方法对试验结果进行统计学分析，分析结果见表4。从表中可以得出，8个梯度油脂添加产生的酶活力变化间差异不显著，可以判断油脂在纳豆生产中对枯草杆菌产纳豆激酶的作用不明显，无明显差异。

再以表2中数据为基础，做出纳豆激酶测定中吸光值随油脂梯度变化曲线（见图2）。

从图中可看出，在显色反应中，吸光值随油脂添加量的变化出现波动，但是规律不是十分明显。同时，在添加1.5mL（每20g）后，纳豆激酶的活性有所提高，但随着油脂浓度的增加，纳豆激酶的活性没有提高的趋势，但根据多组平行试验的分析，以及方差分析结果得出，油脂在纳豆生产中对纳豆激酶的影响作用无显著变化。同时，在测定中发酵的厚度、取样范围及均匀程度均受到一定的限制和影响，因此在测定中便可能会带来很大的误差和波动。

4 结语

本论文利用枯草芽孢杆菌进行纳豆产品的发酵，并且采用不常用的油脂提取后的豆粕作为主要的发酵原料，以此为基准，通过外加大豆油脂来研究纳豆生产中油脂对枯草杆菌产酶的影响，期望以此来判断其影响，从而找到更加廉价的生产纳豆激酶的工业方法，从而达到降低成本的目的，经过单因素试验设计，得出的初步结果如下：（1）影响纳豆发酵产纳豆激酶的因素很多，本论文通过从原料出发，利用豆粕作为发酵基料，经过多组多批次的试验，分析得知，油脂在纳豆发酵过程对枯草芽孢杆菌产酶的影响无显著变化。同时，试验过程中发现在一定油脂含量范围内纳豆激酶的产量会有所提高，在油脂含量在8.64%（按豆粕油脂残留1%计）左右有较大酶活力，多次试验证明，但随着油脂的不断添加，纳豆激酶的出现不太规律的上下波动，趋势变化不明显。（2）在纳豆的取样分析时，由于发酵纳豆杆菌的好氧特性，发现在发酵过程中只有上部表層有白色粘稠类似物出现，三角瓶底部颜色较深，且发酵迹象不明显，所以可以看出在取样时会出现较大的误差，因此，在以后试验时要注意最优厚度的确定，并且尽可能在发酵过程中进行搅拌，达到发酵的均一化保证对所分析因素干扰的排除。

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