低温胁迫下鹿蹄草生理响应变化分析

李文馨　孙彩玉　胡海清等

摘要 [目的]探寻低温胁迫对鹿蹄草的影响机制。[方法]以鹿蹄草叶片为材料，测定不同冷处理条件下叶片各种保护酶（SOD、POD、CAT）、丙二醛、叶片相对电导率、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等含量变化情况。[结果]叶片的SOD酶与POD酶均呈现先升后降的趋势，但变化幅度不尽相同；CAT酶则呈现先降后升的趋势，但变化幅度不大。丙二醛的积累与叶片相对电导率均呈现上升趋势。脯氨酸、可溶性蛋白质和可溶性糖含量随胁迫时间增加呈现出明显的相关性。[结论]该方法研究了低温胁迫对鹿蹄草的影响，为鹿蹄草的合理利用提供了依据。

关键词 鹿蹄草（Pyrola.calliantha H.Andres）；低温胁迫；生理响应

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）05-01361-04

Abstract [Objective] To explore the influence mechanism of low temperature stress on Pyrola calliantha. [Method] The content changes of various protective enzymes （SOD， POD， CAT）， malondialdehyde， leaf relative electrical conductivity， proline acid， soluble protein， soluble sugar in different cold treatments were determined. [Result] The results showed that： leaf SOD and POD enzyme activity were first increased and then decreased， but not the same amplitude， CAT activity is decreased first and then increased， but changes slightly. MDA accumulation and the relative conductivity of leaves are on the rise. Proline， soluble protein and soluble sugar contents show a significant correlation with stress time increasing. [Conclusion] Effects of low temperature stress on Pyrola calliantha were studied， which will provide a reference for reasonable utilization of Pyrola calliantha.

Key words Pyrola calliantha H.Andres； Low temperature stress； Physiological response

鹿蹄草（Pyrola.calliantha H.Andres）屬于鹿蹄草科（Pyrolaceae）鹿蹄草属（Pyrola L. ）多年生小型草本植物，根茎细长，叶常基生，花聚成总状花序。鹿蹄草属植物全世界约有30余种，主要分布于北半球的温带和寒温带地区。我国是其主要分布区，并且种类繁多，共有27种3变种，主要集中分布在西南的四川、云南、贵州、西藏等省和东北的黑龙江大、小兴安岭、吉林长白山地区等[1]。中医学上早就将其作为一种中草药使用。结果表明，鹿蹄草在医学上具有良好的药效。随着中医学对鹿蹄草的深入研究和广泛应用，其作用效果日益为人们所了解和重视，从而引起世界性的关注目前，主要是对鹿蹄草的分布状况、化学成分、医学功能及应用等领域进行了研究[2]。

温度是植物生存和生活的基本环境条件之一，低温是限制植物地理分布的主要因子[3]。鹿蹄草主要分布于我国东北地区，是寒温带针阔混交林的指示植物，抗逆性较强，冬季仍然存活，在寒地区形成了独特的适应寒冷的机制。目前，对于鹿蹄草抗寒研究鲜有报道。笔者通过测定低温胁迫后的鹿蹄草中SOD、POD、CAT活性及丙二醛、叶片相对电导率、脯氨酸、可溶性蛋白和还原糖等含量变化情况，以期为阐明鹿蹄草对低温的适应性规律提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

研究对象。鹿蹄草植株，采自五大连池老黑山地区。移栽入盆，用营养土进行培养，后取长势相同植株移入4 ℃人工气候箱进行低温胁迫处理。

1.1.2

主要试剂。所用试剂均为国产分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1

样品的预处理。设置的低温为4 ℃，连续梯度时间低温胁迫。胁迫时间分别为0、2、4、6、8和10 d 6个梯度。分别取长势一致并无虫害的叶片，用清水洗去表面残留泥土，再用去离子冲洗2遍。将叶片表面残留水分吸干，将叶片切成约0.5 cm2小块，存于锡纸包内，每包0.50 g，液氮冷冻，置于-80 ℃保存，以待备用。

1.2.2

试验地点选择。鹿蹄草材料的低温处理在东北农业大学生命中心实验室4 ℃人工气候培养箱进行；相关生理指标的测定分析在生命中心实验室及实验楼植物生理实验室完成。

1.2.3

生理指标的测定方法。超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑（NBT）法[4]。过氧化物酶（POD）活性活性测定采用愈创木酚法[5]。CAT活性的测定采用紫外吸收法测定[6]。可溶性蛋白质含量采用考马氏亮蓝G-250染色法[7]。可溶性糖含量用蒽酮比色法测定[8]。脯氨酸含量测定采用茚三酮比色法[9]。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[10]。质膜相对透性采用DDS-310型电导仪测定。

1.2.4

数据处理。试验数据采用SPSS17.0进行统计和分析，Excel2003进行制图。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对鹿蹄草SOD、POD和CAT活性的影响

2.1.1

低温胁迫处理对SOD的影响。SOD是植物体内重要的保护酶之一，能够有效的清除体内的自由基[11]。图1表明，4 ℃低温胁迫下植物体内的SOD活性先增高再降低，当低温胁迫时间达到6 d时，SOD酶活性最高，约为初始活性。但随胁迫时间的延长，SOD酶活性大幅度下降。未经胁迫处理的（0 d）与胁迫处理6 d之间的SOD酶活性差异极显著（P<0.01），与胁迫处理2 d的SOD酶活性差异不显著（P>0.01），与胁迫处理4、8和10 d的SOD酶活性差异显著（P<0.05）。

2.1.2

低温胁迫处理对POD的影响。POD作为植物保护酶之一，能够防御外界不良环境，其活性与植物的抗寒性呈有一定的关系[12]。当植物体遭受逆境胁迫时，POD酶可将过剩的H2O2分解为H2O和O2，从而减轻活性氧对植物造成的伤害。图2表明，低温胁迫使植物体内的POD活性呈现增加趋势，并随着胁迫时间增加而活性增强。当胁迫时间在2～6 d，POD酶活性呈现大幅度上升趋势，并在胁迫6 d时达到最大值；但胁迫时间继续延长时，在6～8 d，POD活性呈现下降趋势。未经胁迫处理的（0 d）与胁迫处理6 d的POD酶活性达到差异极显著（P<0.01），与胁迫时间为2 d时间差异不显著（P>0.01），与4、8和10 d的差异显著（P<0.05）。胁迫时间为2 d与胁迫4、8和10 d时间的POD酶活性差异显著（P<0.05）；与胁迫6 d的POD活性呈现极显著（P<0.01）。

2.1.3

低温胁迫处理对CAT的影响。CAT酶是膜脂过氧化防御系统的重要组成部分，能够在逆境胁迫或衰老过程中减少OH-的形成，保护膜的结构，减轻毒害，从而使植物忍耐、减缓或抵抗逆境胁迫或延缓器官的衰老 [13]。CAT酶是植物在低温胁迫下清除体内H2O2的关键酶。图3表明，与SOD酶和POD酶活性相比较，CAT酶出现了低温胁迫活性先降低后升高的趋势，但CAT酶活性随着胁迫时间而降低并且低于胁迫处理0 d的CAT酶活性。在胁迫时间达到6 d时，CAT活性出现最低值，并与胁迫处理0 d的CAT酶活性呈现显著性差异（P<0.05）。

2.2 低温胁迫处理对丙二醛（MDA）含量和相对电导率的影响。

2.2.1

低温胁迫处理对MDA含量的影响。MDA是膜脂过氧化作用的终产物，是膜系统受伤害的重要指标[14]，积累的多少，表明组织的保护能力强弱，细胞膜遭受破坏是否严重。MDA含量的多少能够代表质膜受伤害的程度[15]。因此，MDA可以作为判断植株抗冷害能力的指标之一[16]。图4表明，低温胁迫下，鹿踢草叶片MDA含量出现先上升趋势后下降的趋势。在胁迫时间达到8 d时，MDA含量达到最高。当胁迫时间继续延长至10 d的过程中，MDA又出现了下降趋势。但MDA含量在变化过程中幅度不如其他生理指标变化幅度大。并且各个时间点呈现出不显著差异。

2.2.2

低温胁迫处理对电解质渗漏率的影响。电解质渗漏率是衡量细胞组织和细胞质膜的幼嫩程度和是否收到伤害的指标[17]。研究表明，植物受到低温胁迫时，会引起细胞原生质结构的破坏，导致细胞原生质透性增大，而透性越大，离子渗漏率越高，说明受到的伤害越重，抗寒性也就越弱[18]。图5表明，随着低温时间的加长，植物体叶片电解质渗漏率随时间的增加而变大，当胁迫时间达到8 d时，电解质渗漏率达到最高。当胁迫时间继续延长至10 d的过程中，電解质渗漏率又出现了小幅度下降趋势。但在胁迫过程中，植物体电解质渗漏率变化幅度不大，为缓慢增大过程。并且各个胁迫时间点其电解质渗漏率呈现不显著差异。

2.3 低温胁迫处理对可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量的影响

2.3.1

低温胁迫对可溶性蛋白的影响。蛋白质含量的增加，有助于提高细胞内的束缚水含量，降低冰点，从而成为防止细胞内结冰、避免细胞冰冻死亡的原因之一[19]。研究表明，低温胁迫下，植物可溶性蛋白质含量增加[20-22]。因为可溶性蛋白的亲水性质强，能增强细胞持水力，因而在低温胁迫下，植物体内可溶性蛋白质升高有利于抗冷性的提高。多数情况可溶性蛋白质和总蛋白质的含量与抗寒之间存在正相关。这表明，低温胁迫能引起植物基因表达发生改变，并有新的蛋白质合成，参与抗寒性发育过程[23-24]。图6表明，在低温胁迫的整个过程中，植物体内可溶性蛋白含量在不断身高，当胁迫是时间累计到8 d时，可容性蛋白含量达到最高，当胁迫时间继续延长至10 d时，可容蛋白含量有所下降，但下降幅度不大。未经胁迫与胁迫的各个时间点呈现出差异不显著（P>0.05），且各个时间点均呈现不显著差异（P>0.05）。在整个低温胁迫的过程中，可溶性蛋白的含量变化幅度较小。

2.3.2

低温胁迫对可溶性糖的影响。植物体内可溶性糖的含量与植物对低温胁迫的抵抗力关系密切[25]。糖是植物代谢的基础物质，可为脯氨酸的合成提供必需的氧化还原能力，植物体内糖含量的变化是低温胁迫条件下植物代谢敏感较高的生理指标之一[26]。大量研究表明，植物在低温锻炼过程中，细胞内可溶性糖含量增加，解除锻炼时降低，而且可溶性糖含量的增加是与淀粉水解相平行的[27-31]。图7表明，可溶性糖含量与可容性蛋白含量保持基本走势相同，但可溶性糖含量在胁迫时间达到6 d达到最高值，与未经胁迫时间点可容性糖含量差异显著（P<0.05）。并在可溶性糖含量达到最高后保持基本稳定的含量。

2.3.3

低温胁迫对脯氨酸的影响。游离脯氨酸具有水溶性和水势高，在细胞内积累无毒等特点，因而在植物低温胁迫过程中能作防脱水剂而保护植物[32]。一般情况下逆境中的植物其体内的脯氨酸会大的积累，这是植物对不良环境的一种适应性反映[33]。脯氨酸的积累是由植物体内脯氨酸生物合成激活和脯氨酸降解的抑制共同导致的[34-36]，并非是单因子影响。图8表明，脯氨酸酸含量在胁迫8 d时达到最高值。在0～8 d时，脯氨酸含量随着胁迫时间的增加而增加；当胁迫达到高峰时，可溶性糖含量有所降低。未经胁迫的脯氨酸含量与胁迫8 d的可溶性糖含量呈现出极显著差异（P<0.01）。0 d与6 d、10 d的脯氨酸含量呈现显著性差异（P<0.05）。0 d与2 d、2 d与4 d的脯氨酸含量呈现出不显著差异（P>0.05）。

3 结论与讨论

鹿蹄草主要分布于我国东北地区，喜阴，是寒温带针阔混交林的指示植物，抗逆性较强。当受到低温胁迫时，鹿蹄草本身的某些生理指标有了明显变化。试验结果表明，SOD酶和POD酶的活性均随着胁迫时间的累计而呈现先升后降的趋势，在胁迫6 d时达达到最高，表明保护酶活性上升可能是鹿蹄草对低温胁迫的一种保护性应激反应，与作用底物活性增加有关；但随着温度的进一步降低，植物体内活性氧产生与清除之间的动态平衡被打破，活性氧导致膜脂过氧化，造成膜结构损坏，有害的过氧化产物MDA逐渐积累，造成SOD、POD等保护酶系统被破坏，活性下降。但CAT酶活性开始便随着温度的胁迫时间增加而活性降低，说明CAT酶与植物抗寒性呈现负相关，因为在低温胁迫积累的过氧化氢对CAT酶活性起着重要作用。因此，在试验中，CAT酶并非为植物抗寒性有关。但植物的受逆境胁迫石油SOD酶、POD酶CAT酶共同协同作用完成的，才能是自由基维持在某一较低水平老保护植物蹄本身。

在受低温胁迫时，丙二醛含量呈现上升趋势，但上升幅度保持已稳定水平。MDA作为膜脂过氧化最终产物，是反映细胞膜伤害程度的一个重要指标。试验中，MDA含量出现先升高再降低趋势，可能与在低温胁迫过程中体内通过增加保护酶的活性，尤其是SOD酶和POD酶的活性，发挥保护作用，抑制低温引起的O-2的积累，从而降低MDA含量；但随着温度进一步降低，酶促保护系统受到破坏，清除自由基的能力。细胞膜是与外界环境发生物质交换的主要通道，是细胞感受环境胁迫最敏感的部位[37]。质膜透性直接影响其离子渗漏率，鹿蹄草在低温胁迫下的电解质渗漏率随着低温胁迫时间的增加而相对升高，但变化幅度相对稳定，单一以离子渗漏率说明作为鹿蹄草抗寒性性参考，说明鹿蹄草抗寒性良好。可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸调节渗透势来缓解低温胁迫成为主要的保护因素，三者呈现先上升后下降的趋势，其中脯氨酸能促进蛋白质水合作用，溶解可溶性蛋白，使植物具有一定的抗性和保护作用。在逆境胁迫时，脯氨酸还能维持细胞结构、细胞运输和调节渗透压等，并且其积累指数与植物的抗逆相关[37]。植物体内的可溶性糖会产生一定的变化，随着处理温度的降低，植物体内的可溶性糖含量处于增加的趋势，低温锻炼下，其含量与抗寒性成正相关[38]。同时，糖还是冰冻保护剂，可能对冰冻敏感的蛋白质具有保护作用[39]。

植物体内的抗逆境生理生化变化是一个复杂的多因素调节的过程。为了适应或抵抗极端低温等环境胁迫的影响，鹿蹄草植物从多方面的生理反应或低温适应方来对外界胁迫进行响应，从抗寒物质代谢到酶系统等方面，都有生理反应的共同规律和各自特有的生理抗寒特性；而且要通过抗氧化系统等多种途径不断清除体内由低温胁迫产生的活性氧自由基，控制膜脂的过氧化水平，有效地保护细胞内膜系统结构不受伤害，进而保证植物体本身在低温胁迫环境下各项生理活动的正常进行，以及抵抗外界不良环境胁迫引起的伤害，这些不同变化的共同结果可能强化了植物的生理功能特性，改善了植物的物质代谢，增强了植物的抗寒性和对逆境胁迫的响应能力。

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