广玉兰花总黄酮提取及其抗氧化活性研究

郝玉民　李立祥　易昶寺等

摘要 [目的]筛选广玉兰花中总黄酮的提取方法，并研究其抗氧化活性。[方法]采用乙醇回流提取法对广玉兰花中总黄酮进行提取，采用单因素试验和正交试验考察乙醇浓度、提取温度、料液比和提取时间对总黄酮提取效果的影响，通过超氧阴离子自由基（O2-·）和羟自由基（·OH） 的清除试验，对广玉兰花总黄酮的抗氧化活性进行研究，并与维生素C和抗氧化剂特丁基对苯二酚（TBHQ）进行比较。[结果]利用单因素试验和正交试验确定最佳提取工艺条件为：乙醇浓度70%，料液比1∶40（g/ml），提取时间90 min，提取温度70 ℃；在该提取条件下，总黄酮平均含量为4.896%，总黄酮平均纯度为32.925%。广玉兰花总黄酮对自由基的清除率随总黄酮浓度的增大而上升，总黄酮清除O2-·及·OH的IC50值分别为0.381 0和0.640 6 mg/ml。广玉兰花总黄酮清除自由基的能力高于VC，低于抗氧化剂TBHQ；但当总黄酮浓度达到0.709 2 mg/ml时，其抗氧化效果接近于TBHQ。[结论]广玉兰花总黄酮具有明显体外抗氧化作用，是一种极具开发价值的天然抗氧化物质。

关键词 广玉兰花（Magnolia grandiflora Linn） ； 总黄酮；提取； 抗氧化

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）05-01365-03

Abstract [Objective] To select extraction method for total flavones from Magnolia grandiflora Linn and study its antioxidant activity. [Method] Total flavones were extracted from Magnolia grandiflora by using ethanol reflux extraction method， and the effects of ethanol concentration， extraction temperature， solid-liquid ratio and extraction time on the extraction efficiency of total flavones were separately investigated by using single-factor test and orthogonal experiment. Antioxidant activities of total flavones from Magnolia grandiflora Linn were studied by superoxide anion radical and hydroxyl radicals scavenging tests， and compared with vitamin C and antioxidants TBHQ. [Result] The optimum extraction conditions were as follows： ethanol： 70%， solid-liquid ratio： 1∶40， extraction time： 90 min， extraction temperature：70 ℃. The

average content of total flavones was 4.896%， and the purity of total flavones averaged 32.925%. The results show that， the clearance rate of total flavones from Magnolia grandiflora Linn on free radical raised with the increasing of the concentration of total flavones. The IC50 values of scavenging superoxide anion radicals and hydroxyl radicals of total flavones were 0.381 0 and 0.640 6 mg/ml. The capacity of scavenging free radical of total flavones from Magnolia grandiflora Linn is higher than Vc， but lower than TBHQ. When the concentration of total flavones was 0.709 2 mg / ml， the antioxidant effect close to TBHQ. [Conclusion] The total flavones from Magnolia grandiflora Linn as a natural antioxidant substance of great exploitation value have significant in vitro antioxidant effect.

Key words Magnolia grandiflora Linn； Total flavones； Extraction； Antioxidant activity

广玉兰（Magnolia grandiflora Linn） 系木兰科木兰属（Magnolia）乔木树种。其花蕾的醇提物具有明显扩张血管和降压作用，并对血小板聚集及血栓形成起抑制作用，可能与其所含黄酮成分有关[1]。与广玉兰同科属的白玉兰、望春玉兰和武当玉兰的花蕾是中药辛夷，为名贵中药，已被人们熟知。其性辛温，无毒，有驱风散寒通窍理肺的功效，主要用于治疗风寒头痛、鼻塞、鼻渊、鼻流和浊涕等[2]。辛夷主要有效成分有黄酮、生物碱、木脂素和挥发油等[3]。辛夷的乙醇提取物具明显的抑菌、扩张血管、降血压及对血小板聚集和血栓形成起抑制作用等药理活性[4]。何开躍等用广玉兰叶片制备乙酸乙酯提取物，利用显色反应初步鉴定其成分，再以人工抗氧化剂PG（没食子酸丙酯）和天然抗氧化剂PA（植酸）为对照，测定了其体外抗氧化活性，并用2种体系DPPH·（1，1-二苯基苦基苯肼自由基）和卵磷脂进行评价，结果表明，广玉兰叶片乙酸乙酯提取物有较好的抗氧化作用[5]。樊正球等应用微波辅助顶空固相微萃取法（MAE-HS-SPME） 法从广玉兰叶片中提取出48种挥发性化合物[6-7]。

黄酮类化合物在植物界分布很广泛，目前发现的已达5 000余种，可划分为10大类。其中，黄酮醇类、黄酮类、花青素类、儿茶素类、黄烷醇类和异黄烷醇类等6大类黄酮在饮食中存在更为广泛[8]。黄酮类化合物的药理作用和机制被广泛研究，发现除了明显抗氧化作用外，还有明显改善血脂紊乱、抗炎、抗血小板聚集、抗血栓和保护心脑血管疾病等作用[9]。近年来，大量研究表明黄酮类化合物具有较强的抗氧化活性，同时具有抑菌、抗心肌梗塞等药理保健功能且毒副作用很小，是一类极具开发价值的天然有机抗氧化剂[10]。Sandra R等用化学荧光法对5种不同黄酮类化合物对抗自由基损伤的能力进行了分析测定，确定具有强抗氧化性[11]。Rebai Ben Ammar等研究证明，从Rhamnus alaternus L.叶子中分离得到的3种黄酮类化合物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基有较强的清除作用[12]。

目前，对于广玉兰花总黄酮的研究仅限于总黄酮的提取，而广玉兰花总黄酮的体外抗氧化活性的研究在国内鲜有报道。广玉兰资源丰富，广玉兰花中含有较丰富的黄酮类化合物，却未能被开发利用，造成很大的资源浪费。为了进一步开发和利用广玉兰，笔者对广玉兰花中总黄酮的提取工艺进行优化，并用O2-·和·OH 自由基清除法研究其抗氧化活性，旨在开发广玉兰花中天然活性物质资源，并为广玉兰花资源综合开发与利用，特别是为具备药用价值产品开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

研究对象。鲜广玉兰花，采于安徽农业大学校园内，置于微波炉中杀青处理120 s后，于烘箱中70 ℃烘干，粉碎。

1.1.2

主要仪器。ml204 电子分析天平，购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Vis 7200 紫外可见分光光度计，购自尤尼柯（上海）仪器有限公司； DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱，购自上海-恒科技有限公司；TG16-W 微量高速离心机，购自湖南湘仪离心机仪器有限公司；SHZ-DIII 循环水真空泵，购自郑州英峪予华仪器有限公司；HH-6 型数显恒温水浴锅，购自国华电器有限公司；SENCOR 旋转蒸发仪，购自上海申生科技有限公司；AJF-2001-P超纯水机，购自重庆颐洋企业发展有限公司；NN-S672SF 微波炉，购自上海松下电器有限公司；JFSD-100 粉碎机，购自上海嘉定粮油仪器有限公司。

1.1.3

主要试剂。芦丁对照品，购自成都曼斯特生物科技有限公司；NaNO2、NaOH、Al（NO3）3、VC、无水乙醇、硫酸亚铁、邻二氮菲、盐酸、过氧化氢和邻苯三酚等，均为分析纯；TBHQ（特丁基对苯二酚）为食品添加剂；三羟甲基氨基甲烷（tris）为国产生化试剂，市售。

1.2 方法

1.2.1

广玉兰花总黄酮的测定方法。

1.2.1.1

线性关系的考察[13]。精密称取120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品20 mg，加浓度80%乙醇溶解，定容至100 ml容量瓶中，摇匀，制成0.2 mg/ml对照品溶液。分别取该溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml于10 ml容量瓶中，加0.4 ml浓度5%NaNO2溶液，摇匀放置6 min；然后加入0.4 ml浓度10%Al（NO3）3溶液，摇匀放置6 min；再加4 ml浓度4%NaOH溶液，加水至刻度，摇匀，放置15 min，于510 nm波长测定各吸光度，计算线性回归方程。

1.2.1.2

提取液中总黄酮含量的测定。取1.0 ml广玉兰花总黄酮提取液于10 ml容量瓶中，其余步骤按与标准曲线制作的方法操作，参照空白，测定提取液的吸光度，并利用线性回归方程计算总黄酮的含量。

1.2.2

总黄酮的提取工艺设计。

1.2.2.1

单因素试验。（1）乙醇浓度对广玉兰花中总黄酮含量的影响。取广玉兰花干燥粉末适量，按料液比1∶40（g/ml，W/V，下同）分别加入浓度分别为40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液，提取温度70 ℃，提取时间120 min，测定广玉兰花中总黄酮的含量。（2）料液比对广玉兰花中总黄酮含量的影响。取广玉兰花干燥粉末适量，分别按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50加入浓度为70%的乙醇溶液，提取温度70 ℃，提取时间120 min，测定广玉兰花中总黄酮的含量。（3）提取时间对广玉兰花中总黄酮含量的影响。取广玉兰花干燥粉末适量，按料液比1∶40加入浓度70%的乙醇溶液，提取温度70 ℃，分别提取30、60、90、120和150 min，测定广玉兰花中总黄酮的含量。（4）提取温度对广玉兰花中总黄酮含量的影响。取广玉兰花干燥粉末适量，按料液比1∶40加入浓度70%的乙醇溶液，提取温度分别为40、50、60、70和80 ℃，提取时间为120 min，测定广玉兰花中总黄酮的含量。

1.2.2.2

正交优化试验。在单因素试验的基础上，采用L9（34）对影响总黄酮提取效果的因素进行正交试验，进一步研究各因素对提取效果的影响，筛选出提取最佳工艺参数。因素水平设计见表1。

3 结论与讨论

广玉兰花总黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度为70%，料液比为1∶40，提取时间90 min，提取温度70 ℃；在该提取条件下，总黄酮平均含量为4.896 0%，总黄酮纯度平均为32.925%。由于提取液中醇溶性杂质种类较多，导致总黄酮纯度相对较低。如果在规模化生产中对产品的纯度要求较高时，可进一步进行分离纯化处理。

广玉兰花总黄酮清除O2-·和·OH自由基的IC50值分別为0.381 0和0.640 6 mg/ml，其清除能力均高于VC，低于抗氧化剂TBHQ；但当总黄酮浓度达到0.709 2 mg/ml时，其抗氧化效果均接近于TBHQ，表明广玉兰花总黄酮对O2-·及·OH有良好的清除作用，用广玉兰花总黄酮替代TBHQ作为抗氧化剂使用，能够避免TBHQ自身的毒性，因此可作为一种天然抗氧化剂进行开发利用。

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