操作简单且低成本的木聚糖酶检测方法

邵建忠 潘雪男 夏俊花

在所有单胃动物饲料中，约85 %的饲料被认为至少添加了一种商用酶制剂，饲料配方的成功越来越依赖于这些酶制剂所带来的动物生产性能上的益处。木聚糖酶分析方法上的突破能够确认酶在饲料中的存在及其水平。

中图分类号：S816.17 文献标识码：C 文章编号：1001-0769（2014）06-0012-02

对饲料生产商而言，能够证明饲料成品含有能确保其含有的酶达到正确的含量和活性的标准是饲料质量控制和保证方案的一个重要组成部分。例如，如果日粮在添加木聚糖酶后，其能量水平可以降低，饲料中酶的含量和活性能达到如预计的水平是非常重要的。由于在实现这一目标的过程中出现任何失误，将很可能会导致动物生产性能的显著下降，并随后会导致经济损失，因此需要有一个能够确认成品饲料中酶的存在及其含量的正式且精确的分析方法。

1 酶含量的检测

然而，尽管每年用于释放饲料原料中养分或降低抗营养作用的饲用酶费用超过7亿万美元，但检测成品日粮中酶的实验室检测方法到今仍因昂贵的成本且费时而其应用受到限制。不仅如此，虽然目前有公认的植酸酶的通用质量控制方法，而木聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶或淀粉酶却没有类似的方法。

在大多数情况下，检测方法的开发主要是为了满足某些监管部门的需求，如欧盟的相关部门，而对饲料行业的需求不太重视，后者需要可靠、精确且操作方便、具有成本效益的检测方法。该结果是出现了许多生产商和某些产品专用的分析方法，这些方法通常难以独立运用且成本高，这对需要能够快速、简便、精确和低成本检测方法的饲料生产商或终端用户来说几乎不实用。

另外，目前实验室使用的分析方法往往对实验条件，如pH值、温度和所用反应物的组成成分，微小的变化非常敏感。结果是不同实验室测得的酶活性很可能差异巨大，导致饲料生产商在需要进行质量保证检测时，每次除了将样本送回酶供应商外几乎难以做出其他选择。

2 检测方法的局限性

这种情况很不理想，是AB Vista公司开发一种可以提高饲用酶检测标准（通过克服这些基本问题同时避免目前限制现有检测方法的许多不足）的检测手段的驱动力。例如，先前的方法通常依赖于酶在某些固定条件，如pH、温度、时间和底物浓度下与特定底物相互的作用，随后对最终释放出的终产物进行定量。

换言之，此类方法仅能在一组特定的预定条件下检测酶的活性，因此几乎不可能鉴别饲料原料中添加酶和内源性酶所產生的活性，即使这些内源性酶在动物体内效应有限，但是添加酶以受饲料中抑制因子的影响而限制了其作用。

同样受到关注的是以下事实，即尽管这一方法需要配制相当先进的实验室设备和大约一天的时间方能完成，但其仍不能鉴别不同来源的同类型的酶。在商业性条件下，酶在动物体内的效应相差很大，具体取决于其特性，而酶的特性因来源和开发条件的不同而各异。可以用绝对正确的方法鉴定某种特定酶的能力是非常重要的。

本文还应指出，非基于实验室的分析方法能够正确地预测酶在动物体内的作用。在试管中复制目标动物精确的胃肠道环境简直是不可能的，试管存在能够限制出于基本质量控制目的的任何体外分析方法的局限性。

3 ELISA方法的开发

出于这些原因，AB Vista公司与英国的酶服务与咨询公司（Enzyme Services and Consultancy）的研究人员合作，采用了一种极为不同的方法，以便为能够直接测定饲料中酶及其活性的饲用酶分析方法建立一种新的标准。由此获得的酶联免疫吸附法（ELISA）是基于通过利用一种具有很强针对性及高度准确性的特定抗体—即特定饲用酶的活性形式，捕捉并固定目标蛋白的原理（图1）。

利用为特定饲用酶开发的每一种ELISA方法，该抗体专为匹配位于或靠近完整活性位点上该蛋白质的一部分设计的。这可避免误检饲料加工中甚至部分已变性的任何酶，并能确保不受内源性酶和不同来源的其他添加酶的影响。这本身是饲用酶检测精度上的一个巨大的进步。

随后，捕获的蛋白质（即目标酶）可利用二次反应法（—可产生一种能与规定标准进行比较以确定酶水平的颜色），对酶的存在及含量进行定量。这是一种快速、低成本、高精确的方法，能够在世界各地的任何地方进行，有较高的重复性，对实验和环境条件改变的敏感性低于早先的方法。

每一种ELIAS方法还可用于仅对酶进行快速的检测，或对酶含量进行实际的定量，检测时无需配备任何复杂的设备或专业的检测人员。

4 独特的优点

这是一种独特的方法，且这种新的检测标准已被证明非常成功，因为AB Vista公司早先推出的Quantum植酸酶 ELISA分析法现在加入了Econase XT木聚糖酶的新ELISA方法。对这二种酶，二种类型的ELISA检测试验盒已经完成开发，第一个是QuickStix横向流快速检测试剂盒，可在5 min内对活性酶的商业水平进行定量测定。

QuickStix检测试剂盒能够检测小到单个饲料颗粒中的酶含量，成为饲料生产商出色的质量控制工具，同时它还能证明在通过胃肠道时酶活性的保留情况。每个QuickStix上的二个红色指标标记能够与饲料样本的提取物发生反应，上一条红线可证实QuickStix正发挥着恰当的功能，而下一红线的颜色强度与Econase XT木聚糖酶活性水平呈正比例。

第二个试剂盒是QuantiPlate微滴度试剂盒，能对商用饲料中正常含量内的酶活性进行正确的定量（图1）。在3 h内能够获得正确的检测结果，它被设计成操作简便且易懂。

5 检测结果确认

为确认该结果的精确性和重复性，研究人员添加0 U/kg （图1中样本1）～48 000 U/kg（图2中样本8） Econase XT木聚糖酶的一系列饲料用ELISA QuantiPlate方法和标准湿化学分析法进行分析。结果显示QuantiPlate检测结果与根据添加量预测的饲料中酶含量间极为一致（R2>0.99，P<0.001），证实了这一新的检测方法的稳定性和价值（图2）。湿化学法获得的较高结果是由于其还检测出了大约3 000 U/kg的内源性酶活性，而新的QuantiPlate分析法则忽略了这一活性。

很显然，Econase XT 的QuantiPlate和QuickStix检测法在建立新的、高标准的经济合算且操作方便的木聚糖酶检测方法上起着重要的作用。对那些正在寻找有效质量控制和有保障的程序且尽可能降低对昂贵且费时的实验室检测方法的饲料生产商而言，毫无疑问向前迈出了非常实质性的一步。□□

原题名：Cost-effective and convenient xylanase enzyme analysis（英文）

原作者：Hadden Graham博士（AB Vista公司技术总监）、Noel Sheehan（酶服务与咨询公司经理）