格利特对模拟鸡舍环境中禽流感病毒的杀灭效果

李亚雄　仇正兴

摘 要：为验证在有机物存在下格利特消毒剂杀灭禽流感病毒的能力，试验模拟鸡舍和周围环境的消毒实际情況，在鸡粪中混入H9亚型禽流感病毒，研究格利特消毒剂（20 %戊二醛溶液）杀灭禽流感病毒的效果，结果：1∶100、1∶200和1∶400稀释的格利特消毒剂在4 ℃或25 ℃下作用20 min，均能100 %杀灭混入鸡粪中的H9N2禽流感病毒；1∶200稀释的格利特消毒剂25 ℃下作用 20 min，能杀灭存在于鸡粪和清洁剂中的100 %H9N2禽流感病毒。1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600稀释的格利特消毒剂25 ℃下作用20 min，均能100 %杀灭无鸡粪保护的H9N2禽流感病毒。结论：格利特消毒剂能杀灭有鸡粪保护的禽流感病毒。

关键词：消毒剂；模拟环境；稀释度；禽流感病毒：杀灭作用

中图分类号：S851.36 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2014）06-0068-02

消毒剂种类繁多，常用的消毒剂以成分分类主要有9种：含氯消毒剂、过氧化物类消毒剂、醛类消毒剂、醇类消毒剂、含碘消毒剂、酚类消毒剂、环氧乙烷、双胍类消毒剂和季铵盐类消毒剂。按消毒效果分类有3种：高效消毒剂、中效消毒剂、低效消毒剂。

不同种类的消毒剂因各自的作用原理和含量差异，具有各自的适用范围和消毒浓度，超出适用范围和浓度范围，消毒效果变差甚至根本不能产生消毒效果。

人和动物疫病时有发生，预防疫病发生有三种主要途径：消灭传染源、切断传播途径和保护易感者。有的疫病已经研制出疫苗，可以使用疫苗保护易感者，但很多为老病新发（病原发生了质的变异）或新发传染病，如2013年2月开始在中国发生的H7N9禽流感疫情。

预防和控制流感病毒感染的措施主要集中在阻止病毒的入侵和入侵后控制病毒的进一步传播。流感病毒从呼吸道和消化道排出，污染的粪尿最有可能导致流感在禽群之间传播。

消灭和减少鸡舍和周围环境中病原微生物的最好方法是打扫、清洗后（存在少许鸡粪）消毒。我们知道：带有鸡粪等有机物的鸡舍和周围环境中禽流感病毒的杀灭并不是任何一种消毒剂均能奏效。为选择用于带有鸡粪等有机物鸡舍及其周围环境中禽流感病毒消毒的消毒剂，我们查阅了有关资料，《禽病学》第十一版第153页有如下记载：禽流感病毒（AIV）在一般环境中的稳定性相对较差，通过改变物理因素即可使病毒失活。在有机物存在时，AIV能被化学试剂如醛类、β-丙内酯和二乙基亚胺等灭活，除去有机物（消毒剂单独与AlV作用），则可使用酚类、铵离子、氧化剂（如次氯酸钠）、稀酸和羟胺来破坏AIV。根据以上叙述，我们选择不同稀释度的格利特消毒剂（20 %戊二醛溶液）来研究醛类消毒剂对AIV的杀灭效果。

1 材料

1.1格利特（GLUTEXTM）戊二醛溶液

规格 20 %（g/g），批号：YY00D8N001，生产日期：2013年8月23日（有效期：1年）。

1.2 9～10日龄SPF鸡胚：

梅里亚维通实验动物技术有限公司供应；

1.3 病毒

NJ01株H9N2亚型禽流感病毒尿囊液，病毒含量为107.0EID50左右，江苏省农科院兽医所家禽重大疫病防控研究室分离、保存。

1.4 立白洗洁精

广州立白企业集团有限公司生产，有效期至2014年7月22日。

1.5 0.22μm微孔滤膜过滤器

Millipore Ireland Ltd.产品。

1.6 鸡粪便

取自试验鸡场；生理盐水：自配，pH6.8～7.0；自来水：取自自来水水管，pH6.8～7.0。

1.7 1 %鸡红细胞溶液

实验室自制，现用现配。

1.8 LB固体培养基

实验室自制。

1.9其他材料和仪器

固体石蜡、打孔器、离心机、超净工作台等。

2 方法

2.1 病毒与消毒剂的稀释

先将病毒进行1∶1 000稀释（因为原来的病毒含量为106.5EID50，先1∶1 000稀释后，接种时只需进行10-1、10-2、10-3稀释）；将格利特消毒剂用自来水稀释为1∶33.4、1∶53.3、1∶66.7、1∶133.4、1∶266.7、1∶533.4（v/v）。

2.2鸡粪+病毒+消毒剂

取鸡粪100 g、病毒溶液100 mL搅拌混匀，分出4份，每份10 mL，其中3份分别加入5 mL 1∶33.4、1∶66.7、1∶133.4稀释的格利特消毒剂，使鸡粪∶病毒溶液∶消毒剂稀释液比=1∶1∶1，将每份混合液摇匀后均分为2部分，一部分置4 ℃、另一部分置25 ℃下作用，20 min后取出离心过滤。第4份加入5 mL自来水，作为该组不加消毒剂的病毒含量测定对照，25 ℃下作用20 min后取出离心过滤。

2.3 病毒+消毒剂对照

取病毒溶液60 mL，加入60 mL自来水搅拌混匀，分出5份，每份10 mL，其中4份分别加入5 mL 1∶66.7、1∶133.4、1∶266.7、1∶533.4稀释的格利特消毒剂，使自来水：病毒溶液：消毒剂稀释液=1∶1∶1。第5份加入5 mL自来水作为病毒+自来水对照。均置25 ℃作用20 min后取出离心过滤。

2.4 鸡粪+病毒+清洁剂+消毒剂

取鸡粪50 g、病毒溶液50 mL、10 mL l：400稀释的洗洁精溶液混匀，取出2份，每份11 mL，其中l份加入4 mL 1∶53.3稀释的格利特消毒剂，使鸡粪∶病毒溶液∶洗洁精溶液∶消毒剂稀释液=5∶5∶1∶4。将混合液摇匀后均分为2部分，1份置25 ℃作用，20 min后取出离心过滤。第2份加入4 mL自来水作为该组不加消毒剂的病毒含量测定对照，25 ℃作用20 min后取出离心过滤。

2.5 病毒+生理盐水对照

取病毒溶液2 mL，加入4 mL生理盐水混匀，25 ℃作用20 min后取出离心过滤。用于测定病毒在生理盐水介质中的病毒含量，与其它各对照组的病毒含量进行比较。

为了清楚明了，将分组和稀释结果概括见表1。

2.6 稀释、接种和观察

将以上所有过滤液用灭菌生理盐水分别进行10-1～10-3 的10倍倍比稀释。病毒+生理盐水对照进行10-1～10-6的10倍倍比稀释，每一份过滤液的各稀释度均尿囊腔途径接种3枚SPF鸡胚，O.1 mL/枚，置37 ℃温箱进行孵化，每天上下午各照1次，死肝及时取出，至120 h将活胚取出冻死。

2.7收获和检测

无菌收取所有死胚和活胚的尿囊液，测定其血凝价（HA），另对36 h前死肝尿囊液进行无菌检验。

2.8病毒含量的计算

根据鸡胚感染情况，计算各过滤液的病毒含量。

2.9消毒效果判定

根据有消毒剂作用组和无消毒剂对照组的病毒含量测定，判断消毒剂的消毒效果。

3 结果

3.1鸡胚感染比例

所有处理项的各稀释度鸡胚感染比例见表2，以HA≥ 2 log2判为感染。

3.2 病毒含量

根据鸡胚感染情况，按Reed和Muench法计算出各处理项的病毒含量，结果见表2。

4 结论

4.1 通过实验验证了《禽病学》第十一版153页的观点：在有机物（如鸡粪）存在时，AIV

4.2在有鸡粪保护的4 ℃或25 ℃下作用20 min，1∶400以下稀释的格利特消毒剂能够100 %杀灭鸡粪中的AIV。温度对格利特消毒剂消毒效果的影响很小。

4.3 25 ℃下作用20 min，1∶1 600以下稀释的格利特消毒剂能够100 %杀死无鸡粪等有机物保护的AlV。

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