在中医院校研究生中开设“激光扫描共聚焦显微术”的探索

尹素改 张颖 陈玉龙

【摘要】激光扫描共聚焦显微术是目前最先进的分子细胞生物学研究技术之一，随着激光扫描共聚焦显微镜性能的不断提高，该技术在生物及医学领域的应用越来越广泛，并逐渐成为生物医学实验研究的必不可少的研究手段。医学院校研究生作为集自然科学、生命科学、医学科学和实验技能为一身的高级专门人才，必须了解和掌握这一科研技术。

【关键词】激光扫描共聚焦显微术医学院校探索

【课题项目】河南中医学院苗圃工程项目：MP2012-02；教育部新世纪优秀人才支持项目, 项目编号为：NCET-11-0946。

【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2014）07-0249-01 激光扫描共聚焦显微术 (Laser scanning confocal microscope，LSCM)是20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术[1]，是在传统光学显微镜的基础上，结合激光、电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段而形成的先进的细胞分子生物学分析技术。因其独特的激光扫描装置具有不损伤细胞、分辨率高、实现多重荧光共定位且能观察样品的三维图像等优点，已被广泛应用于形态学、细胞生物学、分子生物学、发育生物学、神经科学、药理学、遗传学和环境科学以及抗肿瘤药物研究等领域[2]。在三年的教学实践中，我们得到了以下几点经验:

一、教材编写

激光扫描共聚焦显微术作为一门实验技术，必须以理论为基础。但激光扫描共聚焦显微术应用过于广泛，开设的课时有限，加上目前没有非常权威和经典的教材，所以要针对学生的情况和专业来精选授课内容，编写教材，让学生既能看懂，又能学以致用。

二、课前准备

首先，教师在上课前应做好充分准备。教师强烈的责任感和事业心及熟练的实验技能，对学生起着潜移默化的作用。教师要做好课件，充分利用多媒体，在平时实验时可以进行DV 拍摄，然后在课堂上观看，结合理论知识进行总结、分析。要求学生课前预习，让学生明确目的、要求及所需物品、器材等，“知其然，知其所以然”，这样才能提高学生的实践能力。另外，让学生参与课前准备工作，可以在督促同学做好课前预习的同时，培养学生科学的实验态度，增强其动手能力。

三、教学过程

1.加强“激光扫描共聚焦显微术”基础理论的讲解：激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统，相对比较复杂，单纯的讲述难以达到教学目的。在教学实践中，仪器原理及应用介绍要紧密结合，对照仪器，现场讲述，从原理到应用，从基础研究到临床研究，以学生熟悉的实验为例子，既丰富了实验内容，又加深了学生的理解，使理论介绍更加通俗易懂。

2.完善教师示教内容：教师不但要讲样品制作的一般流程和上机检测的步骤，对于上机前样品处理过程和一些需要注意的细节也要边示范边讲解。例如用PI/annexin V-FITC法检测贴壁细胞凋亡[3]，实际操作时，采用PI和Annexin V 分开染，即，PI先染，离心去掉染液后，再加结合液和Annexin V，10min 后上机检测；而试剂盒说明书上是PI和Annexin V同时染。经过试验比较，我们发现分开染可以减少实验误差，因为PI本身对细胞也是有毒性的。通过这样的细节告诉学生: 实验是一个非常严谨的实操过程，需要勤动手，爱动脑，任何一个小的细节都会对实验结果产生影响。

同时一些操作细节也要告诉学生，比如：为控制其他因素对观察结果的影响，不同样品的片子之间保持激光电压在扫描时相对稳定，激光电压和增益一致以及扫描头接收光波波谱范围一致的前提下，扫描细胞多个断层后得到的扩展焦点图作为最终的图形结果；为了减少因荧光淬灭或漂白带来的影响，在成像之前接受可见光和激光照射的时间尽可能短而且相等；在实验中所用的载玻片和盖玻片尽可能薄，玻面光洁，厚度均匀，使用前应清洁液、乙醇液、蒸馏水泡洗，以消除杂质荧光；盖玻片覆盖标本后立即用无标本腐蚀作用的缓冲甘油封片，甘油要求没有自发荧光。

3.在实验中培养学生的科研精神：从检测目的到荧光染料选择、从数据获取到结果分析，引导学生进行实验步骤的设计。适当增加流式细胞术应用中的一些新技术新方法，提高学生的学习积极性和对科研的兴趣。如细胞凋亡检测，可以将学生分成两组，第一组用PI/annexin V-FITC法，第二组用线粒体跨膜电位变化的检测法。这两种方法都能检测细胞的早期凋亡，但效果是不同的。

4.及时小结，不断提高: 实验完成后，要求学生用理论知识解释实验结果，然后教师归纳总结，分析各组实验过程中的经验和不足，进一步巩固激光扫描共聚焦显微术的相关知识，加强记忆。这样，使学生在取得丰富的感性认识的基础上，透過现象看本质，从而将感性认识上升到理性认识。

在中医药领域中，激光扫描共聚焦术的应用日益广泛 。所以我们在研究生中开设的这样的课程，这是一个新的尝试，学生反馈情况良好。在以后的教学中，我们将继续探索好的教学方法，进一步提升实验教学水平，促使学生在实验中学会思考、主动分析、研究问题，更好地掌握专业知识和技术，为今后的职业发展奠定坚实的基础。

参考文献：

[1] White J.G. et al. Confocal microscopy comes of age [J]. Nature(London), 1987,328: 183-184.

[2] Brakenhoff G.T.et al.Three dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy[J]. Micros,1989,153(2): 151-159.

[3] 王书奎，周振英．实用流式细胞术彩色图谱[M].上海: 第二军医大学出版社，2004: 95-326．

[4] 代志军，王西京，薛茜等．半枝莲含药血清对肝癌H22细胞凋亡及线粒体膜电位的影响[J].中西医结合学报, 2008,6 ( 8 ) : 821-826.