蚓激酶在血栓形成过程中作用研究*

徐 晓 夏，俞 腾 飞

（1.包头市包钢第三职工医院药械科，内蒙古 包头014010;2.内蒙古医科大学 药学院，内蒙古呼和浩特 010030）

蚓激酶在血栓形成过程中作用研究*

徐 晓 夏1，俞 腾 飞2

（1.包头市包钢第三职工医院药械科，内蒙古 包头014010;2.内蒙古医科大学 药学院，内蒙古呼和浩特 010030）

为验证由蚯蚓中提取的蛋白组分—蚓激酶与血栓形成及血栓形成后溶解血栓的关系，本实验采取了动物实验的方法进行药理学研究。首先取雄性大鼠75只，将其随机分为五组，分别命名为空白对照组、阳性药对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。通过小动物血栓形成仪造模，然后分别对五组给予生理盐水（1.0ml/kg）、低剂量注射液（0.3mg/kg）、中剂量注射液（0.6mg/kg）、高剂量注射液（1.2mg/kg）以及阳性药注射液（1.1ml/kg），给药方法为每日尾静脉给药，连续给药15天。15日后测量血液凝血酶时间（thrombin time TT）、血浆复钙时间（recalcification time，RT）和血小板最大聚集率，并剥离颈部动脉血栓测定血栓重量。结果显示，蚓激酶对于大鼠血液的RT、TT时间均有有效的延长作用，并且对于血栓形成后的血栓溶解也有明显的作用，且这些作用都与蚓激酶剂量成依赖性关系。本实验结论为蚓激酶极可能具有延长血栓形成时间和使外静脉血栓溶解变小的作用。

蚓激酶;抗血栓;凝血酶时间;血浆复钙时间;血小板最大聚集率

伴随血栓栓塞性疾病的高发病率和强致死致残率，其已成为我国和不少西方国家人口死亡和致残的第一大原因［1－3］。自1983年Mihara等首次在蚯蚓中提取出了具有溶解纤维蛋白和激活纤维蛋白酶原活性的酸性蛋白质，即蚓激酶，相比较于现在常用的治疗血栓的药物尿激酶、链激酶等更加的安全，不易引起出血，因此研究蚓激酶的药理学机制及其临床用药方案具有很重要的意义［1，4－8］。

本实验利用蚓激酶测试了其对大鼠颈动脉血栓形成的缓解作用和血栓的溶解作用进行了药理学检验，将为蚓激酶对血栓的控制和治疗的临床应用提供实验基础［9，10］。

1 材料与方法

1.1 动物材料

雄性Wistar大鼠75只，体重200－300g

1.2 药品与试剂

蚓激酶:30U/mg

阳性药物:脉络宁注射液（1.1 ml/kg）

凝血酶时间测定试剂盒:由上海太阳生物技术有限公司提供

1.3 仪器

电子天平 （日本岛津LIBRORAEL－200）

YLS－14B小动物血栓生成仪（济南益延科技发展有限公司）。

BT 87－2 实验性体内血栓形成测定仪（包头医学院心血管研究室）。

LBY－NJ4血小板聚集仪（北京普利生仪器有限公司）。

1.4 模型的建立

将75只大鼠用30－50mg/kg的戊巴比妥进行腹腔注射麻醉，将其仰卧位固定，然后进行颈部正中切口，剥离大鼠右侧颈动脉，约15mm长，以小块塑料布阻隔伤口周围的组织，确保颈动脉已分离干净，用血栓生成仪的刺激电极和红外血流检测探头夹起颈动脉，检测搏动信号，稳定后开始电刺激，肉眼可见动脉由红色逐渐变为黑色。以血栓形成测定仪报警并稳定约30秒后撤除检测探头，并对实验大鼠进行伤口消毒和缝合处理。三天后，将75只大鼠随机分配成五组，分别标记为空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性药对照组，各组采用尾静脉给药方式，分别注射生理盐水（1.0ml/kg）、低剂量注射液（0.3mg/kg）、中剂量注射液（0.6mg/kg）、高剂量注射液（1.2mg/kg）以及阳性药注射液（1.1ml/kg）的给药量，每日一次，连续给药15天。

1.5 大鼠颈动脉血栓的剥离及血栓重量的称量

末次给药当天，将大鼠用30－50mg/kg的戊巴比妥进行腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位固定，以酒精消毒大鼠尾部及手术剪，剪掉大鼠尾部末梢1－2cm部分，以试管收集大鼠血液，取血后将血液用EP管进行分装。再进行颈部正中切口，剥离右侧颈动脉，取出右侧颈动脉血栓段血管，显微镜下进行动脉周围组织与血液的清理，分离出血栓，用滤纸吸干后放入干燥箱，60℃干燥一小时后用电子天平称取血栓重量。

1.6 大鼠凝血酶时间的测定

经大鼠腹主动脉取血0.2ml，加入 TT试剂0.2 mL，同时以秒表计时。每隔5 s倾斜EP管1次，记录纤维蛋白凝固（管内血液液面不动）所需的时间即为凝血酶时间。

1.7 大鼠血浆复钙时间的测定

经大鼠腹主动脉取血5ml以3.8%的枸橼酸钠（1∶9）抗凝，500r·min－1离心 5 min，取上清液备用，再以 3000r·min－1离心10min，取上清液备用（第一次取出的上清液为富血小板血浆Platelet－rich plasma，PRP，第二次取的上清液为贫血小板血浆 Platelet－ poor plasma，PPP）。取 PRP0.1ml加入生理盐水0.1ml混匀，置于37℃水浴中1min后，加入 0.025mol·L－1CaCl2溶液0.1 mL混匀，同时以秒表计时，每隔5 s倾斜EP管1次，直至出现纤维蛋白丝使液体不再流动停止计时，记录时间即为血浆复钙时间。

1.8 大鼠血小板聚集率的测定

方法同1.7，分别取0.2mlPPP和0.2mlPRP 放入血小板测定仪配套方杯中，以PPP调节仪器检测零点。再用仪器测定PRP相对血小板浓度，待数值稳定后取PRP置于37℃水浴中5min，加入诱导剂3μmol/L ADP 5μL混匀，用血液聚集仪测试血小板聚集状态，仪器显示为血小板最大聚集率。

1.9 统计学处理

利用SPSS19.0统计软件对以上数据进行处理，用单因素ANOVA方差分析进行多组间比较，以LSD法进行两两比较，各组测定值以x±s表示。

2 结论

2.1 蚓激酶对大鼠颈动脉血栓重量的影响

与空白组比较，蚓激酶高剂量组和阳性药组对大鼠颈动脉血栓重量的影响有显著的缩小的作用（p值＜0.05），虽然蚓激酶低、中剂量组对颈动脉血栓没有统计学有意义的影响，但在一定程度上也起到了缩小血栓的作用，且从蚓激酶低、中和高剂量组的组内比较可以发现蚓激酶对血栓作用的影响作用成剂量依赖性。（见表1）

2.2 蚓激酶对大鼠血液凝血时间的影响

与空白组比较，蚓激酶中、高剂量组以及阳性药组对实验大鼠凝血时间TT时间明显延长（p值＜0.05），而蚓激酶低剂量组虽然与空白组比较没有统计学有意义的变化（p值＞0.05），但是从蚓激酶低、中及高剂量组的组内比较可以发现蚓激酶对大鼠凝血时间的影响具有剂量依赖性。（见表2）

表1:蚓激酶对大鼠颈动脉血栓重量的影响（x±S）

表2:蚓激酶对大鼠血小板最大聚集率的影响（x±S）

2.3 蚓激酶对大鼠血浆复钙时间的影响

与空白组比较，蚓激酶中、高剂量组以及阳性药组对实验大鼠血浆复钙时间的影响都表现出了统计学意义的延长作用（p值＜0.05），而蚓激酶低剂量组没有统计学有意义的延长作用，但是也延长了血浆复钙时间。（见表2）

2.4 蚓激酶对大鼠血小板最大聚集率的影响

与空白组比较，仅有阳性药物组对实验大鼠的血小板最大聚集率的影响有统计学意义，而蚓激酶未表现出具有统计学意义的试验结果，但是在一定程度上可以看出其对血小板最大聚集率有一定程度的降低作用。

3 讨论

大量实验及临床研究证实，血栓的预防主要从扩张血管和降低血液粘稠度等方面入手，传统的扩张血管的药物能有效地扩张心血管，但往往会造成血管壁变薄变脆等问题，因而降低血液粘稠度的预防手段现阶段更为科学家们所热衷。通过药物能够降低血小板凝聚功能，从而降低血液粘稠度，达到活血化瘀的功效，本实验发现蚓激酶正是针对预防血栓形成而具有良好功能的药物。

蚓激酶对血小板粘附的抑制作用在本实验中得到验证，且有显著的溶栓作用，这就决定了蚓激酶不仅可以作为血栓形成的预防性药物，也可作为血栓形成后的治疗及愈后药物。此药来源于生物体，易养殖好提取，药物来源极其丰富，且价格低廉，又几乎没有毒副作用，所以就有很好的成为血栓栓塞性疾病预防治疗及愈后的主流药物的潜质。

血纤维蛋白原与血栓的发生发展和愈后有密切的关系，蚓激酶作为溶栓药物，具有抑制血栓形成、改善微循环和溶解血栓的作用，最主要的是蚓激酶具有不易出血的安全性，使其更加适合于作为新型的溶栓药物而被开发和利用。但蚓激酶在蚯蚓体内提取的过程较复杂且不确定因素较多，所以近几年国内外都在进一步为蚓激酶的临床应用做着不断努力。

以往研究证实，有效的抗血小板活性的治疗方案，在血栓治疗中有比较积极的作用，蚓激酶对血小板粘附有抑制作用，本实验中蚓激酶中剂量组与高剂量组血小板聚集率与空白组比较有所降低，但差异不显著，提示其可能具有抑制血小板聚集的作用，能抑制血栓形成。但未出现显著作用效果可能是由于剂量的原因，也可能是蚓激酶不仅仅通过对血小板的粘附作用对血栓产生影响。

［1］Cotuk A.Lysozyme activity in the coelomic fluid and coelomcytes of the earthworm Eisenta Foetida，sav in relation to bacterial infection［J］.Comp Biochem Physiol A，1984，78A:467－474.

［2］王洪武，李次芬，王士雯.蚓激酶对凝血、纤溶功能的影响［J］.天津医药，1991，19（2）:73

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［4］牛勃，等.双胸蚓纤溶酶Ⅲ的分离纯化及其性质研究［J］.山西医学院学报，1996，27（2）∶81 －83.

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［6］Fan Q，Wu C，Li L，et al.Some features of intestinal absorption of intact fibrinolytic enzymeⅢ －1 fromLumbricus rubellus［J］.Biochim Biophys Acta，2001，1526（3）∶286 －292.

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Study on the Effect of Lumbrokinase in Thrombus Formation Process

XU Xiao－xia1，YU Teng－fei2
（1.Pharmacy and Instrument Department，the Third Hospital of Bao Gang，Baotou 014010;2.Pharmacy Department of Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010030）

To verify the extracted protein components by earthworms—lumbrokinase，and the impact on thrombosis and thrombolytic with lumbrokinase，the experimental method adopted animal experiment for pharmacology studies.First，taking 30 male rats and dividing them randomly into five groups，named as blank control group，positive control group，low－dose group，middle－dose group and high －dose group.Through the small animal thrombosis instrument modeling，then the five groups were given normal saline（1.0ml/kg），low －dose injection（0.3mg/kg），middle －dose injection（0.6mg/kg），high －dose injection（1.2mg/kg）and positive drug injection（1.1ml/kg）.Method of administration is intravenously administered per day for consecutive 15 days.After 15 days，we measured blood thrombin time（TT），plasma recalcification time（RT）and the maximum platelet aggregation rate and stripped the neck artery thrombosis and measure the thrombus weight.The results showed that lumbrokinase can effectively extend the RT，TT for the blood of rats，and it also has significant effect on thrombolysis.And these effects are dose－dependent relationship with the lumbrokinase.The experiment concluded that the lumbrokinase is likely to have a role in prolonging thrombus formation time and dissolving the external thrombosis smaller.

Lumbrokinase;Anti－Thrombosis;Thrombin Time;Recalcification Time;Maximum Platelet Aggregation Rate

Q55

A

1004－1869（2014）02－0026－03

10.13388/j.cnki.ysajs.2014.02.007

2014－03－20

徐晓夏（1985－），女，内蒙古包头人，包钢第三职工医院药械科药师。